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DATS逆转人类骨肉瘤多药耐药株耐药及对类肿瘤干细胞作用的初步研究

李季  
【摘要】: 研究背景:骨肉瘤是骨外科常见于青少年患者的恶性肿瘤,虽然近年来在外科手术以及新辅助化疗上取得了很大进展,但死亡率仍很高。骨肉瘤易复发转移及患者对化疗药物的原发或继发耐药是导致治疗失败的主要原因。尽管临床已开发出多种针对肿瘤耐药的药物,但临床疗效仍不满意,肿瘤干细胞假说为探寻骨肉瘤的发生转移及耐药机制,寻找有效治疗药物指明了方向。 肿瘤干细胞(Tumor stem cells)的发现为揭开肿瘤的发生、发展及侵袭转移耐药机制,寻找肿瘤预防治疗的方法等展示出广阔的前景。早在上世纪中叶,科学家们从恶性畸胎瘤与胎儿组织的相似性,特别是癌组织与胚胎组织相似的多向潜能分化性,认识到二者可能密切相关。近年来的研究表明,在白血病以及部分实体瘤中(如乳腺癌、脑瘤等),只有一小部分肿瘤细胞具有无限增殖能力,并可形成新的肿瘤灶,这种细胞被认为是肿瘤干细胞。当前所指的肿瘤细胞的异质性不仅包括肿瘤内细胞的异形性,对化疗放疗反应的差异以及侵袭和转移能力的不同,还包括肿瘤中存在有肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞。多数细胞没有无限增殖和成瘤能力,只有肿瘤干细胞可自我更新产生新的肿瘤干细胞和无致瘤能力的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞假说的提出是人类认识肿瘤发生机制的一大进步,它在理论上丰富了肿瘤发生的理论,在临床实践中提示人们杀伤肿瘤细胞(虽然它们也不断地增殖)并不能治愈肿瘤,原因是肿瘤干细胞表达ABC转运蛋白,参与多药耐药,并表达与干细胞共同的维持未分化的关键调控基因,如Sox2,Nanog,Oct4等,能够保持并具有很强的自我更新能力和抗凋亡能力,使得它们可逃逸当前的标准治疗方法,成为复发转移的“源泉”,因此,肿瘤干细胞被认为是肿瘤治疗研究的新靶点,成为根治恶性肿瘤的希望所在。 寻找肿瘤干细胞的表面分子标记,一直是研究的热点。1997年,Bonnet等研究发现,人急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的CD34+CD38-亚群细胞,虽然仅占总数的0.2%,但是唯一可在免疫缺陷鼠具有成瘤性的细胞;2003年,Singh SK等发现脑肿瘤细胞在无血清培养中仅占总细胞数少数的CD133+群细胞可形成肿瘤细胞球,而CD133-群细胞不能形成,在第二年他们又发现CD133+群细胞移植到NOD/SCID鼠脑内,可诱发脑肿瘤,但CD133-群细胞却不能。2006年后,研究发现越来越多的肿瘤干细胞与CD133+群细胞有关,Suetsugua从肝癌细胞株Huh-7中,Ricci-Vitiani L和O'Brien CA分别在结肠癌组织中均分离出CD133+细胞,并证明该群细胞为肿瘤干细胞。目前,骨肉瘤肿瘤干细胞尚无公认的表面标记。 当前的许多研究认为,肿瘤干细胞是造成肿瘤耐药的最根本原因,肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。现有治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞,而不是肿瘤干细胞。肿瘤干细胞与正常干细胞具有许多相似的特征,如大多处于细胞周期的G0期,具有自我更新和分化能力,表达特定的干细胞表面标记,共用相同的干细胞调控通路等。研究证明,肿瘤干细胞致瘤性强,并多表达特异性的ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassettetransporter,ABC transporter),如ABCB1、ABCG2等介导的膜泵耐药分子,使其对化疗天然耐药。ABCB1、ABCG2是从肿瘤组织中分离出来的最基本的肿瘤多药耐药基因,ABCB1编码P-gp,ABCG2编码BCRP;这些转运蛋白通过利用ATP分解产生的能量主动将细胞内的药物泵出,从而保护自身免受细胞毒性药物的损伤,对化疗药物不敏感。肿瘤干细胞高表达这类分子,可以将化疗药物泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,导致肿瘤化疗后少数肿瘤干细胞仍然存活,目前认为这是肿瘤耐药、复发转移的重要机制。 为了寻找逆转肿瘤多药耐药的方法,科学家们实验了许多药物,诸如:钙离子通道阻滞剂,免疫抑制剂以及激素类药物等等药物,取得了一定的效果,但是,这类药物在产生逆转效应剂量上,都具有一些毒副作用,限制了临床应用。因此,许多研究者开始转向一些天然药物。大蒜中的成分DAS,就已经被证明在低毒性的剂量上,有能力逆转P-gp介导的K562白血病耐药株的多药耐药性。近年来的流行病学研究已经证实,大蒜与人体许多种癌症的发病率下降有密切的关系,这应归功于从粉碎的新鲜大蒜中提取的有机硫化合物(organosulfurcompounds,OSCs),主要包括DAS(diallyl sulfide,二烯丙基一硫化物)、DADS(diallyl disulfide,二烯丙基二硫化物)、DATS(diallyl trisulfide,二烯丙基三硫化物,又称为大蒜素)。我们曾经对DATS对于骨肉瘤细胞系Saos-2作用进行研究,发现DATS对Saos-2细胞具有明显的抑制作用。而对于DATS是否具有和DAS类似的逆转P-gp介导的多药耐药性的作用,目前还未见有报道。 本研究对人类骨肉瘤及Saos-2细胞系中的肿瘤干细胞标记物CD133表达进行研究,并用免疫磁珠细胞分选(MACS)方法分离Saos-2细胞系中的CD133阳性(CD133+)群细胞,对其分化、细胞周期、致瘤性以及与多药耐药相关和干细胞调控相关的MDR1、Sox2基因表达进行研究,以研究该群细胞的干细胞特性。使用逐步递增氨甲喋呤(MTX)浓度方法诱导建立骨肉瘤多药耐药系Saos-2/R,评估大蒜素(DATS)逆转骨肉瘤耐药的能力,并研究DATS逆转耐药后,培养基中MTX对Saos-2/R中肿瘤干细胞标记物CD133表达百分率的影响。 目的:检测肿瘤干细胞的表面分子标记CD133在骨肉瘤组织细胞中的表达,分析骨肉瘤细胞系Saos-2中CD133+群细胞的干细胞特性。以Saos-2为母本,诱导建立骨肉瘤耐药细胞系,研究大蒜素(DATS)逆转骨肉瘤耐药的潜力,并研究逆转耐药前后,对骨肉瘤肿瘤干细胞群的影响。 方法:免疫组化研究CD133的表达:取自本院病理科的骨肉瘤常规石蜡包埋组织蜡块标本55例,其中骨旁骨肉瘤4例,纤维母细胞型骨肉瘤13例,软骨母细胞型骨肉瘤12例,骨母细胞型骨肉瘤26例,切成3μm的组织切片备用。取Saos-2细胞系对数增长期细胞,传代于放置有消毒后盖玻片的培养皿中,培养24h制备细胞爬片,使用70%乙醇固定20分钟备用。CD133表达流式细胞仪分析:分析对数生长期的骨肉瘤细胞系Saos-2细胞的CD133表达百分率。分离去除死细胞后,使细胞与CD133-PE抗体结合,上机检测CD133表达百分比率。CD133+Saos-2细胞分化研究:检测CD133阳性细胞加入完全培养基前后的细胞周期及CD133百分率变化;收集细胞后,按照操作手册,MACS去除死细胞,然后同样用MACS方法分离CD133+群细胞,流式细胞分析该群细胞在加入全培养基前的第0天,以及加入全培养基后第3及10天的CD133阳性细胞群的百分率的变化,并以Saos-2细胞做对照,分析第0天及第10天的细胞周期变化。CD133+/-群细胞MDR1,Sox2基因表达Real-time PCR分析:使用Real-time PCR分析CD133+群细胞涉及多药耐药及干细胞分化调控的关键基因MDR1、Sox2的表达情况;收集细胞,按照操作步骤去除死细胞,分选出CD133+/-群细胞,按照步骤行RNA抽提及逆转录,并行Real-time PCR分析。CD133+/-群细胞平板克隆形成实验:细胞平板克隆形成实验检测CD133+/-群的细胞克隆形成能力,分析其致瘤性差别;收集细胞后,按照操作手册,MACS去除死细胞,然后MACS方法分离CD133+/-群细胞,将细胞悬液做倍数稀释,按每皿150、100、200个细胞梯度密度,分别接种于含10ml预温37℃培养液的培养皿中,晃动培养皿使细胞分散均匀,将平皿移入培养箱中,在37℃,5%CO2及饱和湿度环境下,静止培养3周,将平皿放置在显微镜下,肉眼直接计数克隆数,按照公式:克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100,计算克隆形成率。 使用氨甲喋呤(MTX)浓度递增法诱导培养Saos-2细胞系,使Saos-2逐渐产生耐药性,命名为Saos-2/R,使用RT-PCR及Western blotting方法研究其P-gp(MDR1)的表达情况;使用MTT法验证Saos-2/R对多种化疗药物的药物敏感性变化,确定其是否产生多药耐药;DATS逆转耐药研究:应用含梯度浓度的DATS的完全培养基孵育Saos-2/R 48h,RT-PCR及Western blotting方法检测Saos-2/R的P-gp(MDR1)表达变化,分析能够下调P-gp(MDR1)表达的最低DATS逆转浓度;MTT药敏实验检测DATS作用后,Saos-2/R对不同化疗药物敏感性的变化。DATS逆转耐药后对CD133+群细胞的影响:使用含有最低逆转浓度的DATS及梯度浓度MTX的完全培养基孵育Saos-2/R细胞48h,并与不含DATS,但含有同样梯度浓度MTX完全培养基孵育的Saos-2/R细胞做对照,流式细胞仪分析梯度浓度的化疗药物MTX对Saos-2/R中的CD133+群细胞所占比例的影响。 结果:在人体骨肉瘤组织中普遍存在CD133+群细胞,约占5-14%,而在对人类骨肉瘤细胞系Saos-2的研究中发现,CD133+群Saos-2细胞在Saos-2细胞中约占5%左右,在使用MACS分离提纯后,对比CD133+群细胞在加入完全培养基前后的细胞周期及CD133表达百分率变化,发现CD133+群百分率在第0,3及10天出现迅速的时间依赖性下降,并且第10天时的细胞周期的G0/G1,G2及S期细胞比例与对照组Saos-2细胞的细胞周期相似,而与第0天细胞周期相比,第10天的细胞周期G0/G1期细胞明显减少,G2及S期细胞比例明显增加。我们还发现CD133+群比CD133-群细胞具有更高的细胞克隆形成率,并且CD133+群细胞与CD133-群细胞相比过表达MDR1及Sox2基因,而MDR1了是肿瘤干细胞耐药性的一个重要原因,Sox2基因则是干细胞调节网络的核心因子之一。 RT-PCR及Westem blotting结果显示,Saos-2/R相对于Saos-2细胞过表达P-gp(MDR1),MTT药敏实验显示Saos-2/R细胞对多种化疗药物耐药,具有多药耐药性,DAYS逆转耐药实验显示,随着DAYS梯度浓度增高,Saos-2/R的P-gp(MDR1)表达出现浓度依赖性下调,10μM DATS即可有效下调P-gp(MDR1)表达,MTT实验显示,10μM DATS存在下,Saos-2/R对多种化疗药物的敏感性增加,多药耐药性被逆转。使用CD133作为肿瘤干细胞标志物,研究了耐药株Saos-2/R在DAYS逆转耐药后,CD133+群细胞比例的变化。我们假设CD133+群的细胞百分比在DATS逆转耐药后,会无法耐受化疗药物的毒性而出现下降。我们检测对比了仅有梯度浓度MTX孵育的和同时有DAYS存在的Saos-2/R细胞中的CD133百分比率,我们发现,在没有DATS存在下,CD133+群百分比率在梯度浓度的MTX作用下是稳定的,但是在10μM DAYS存在下,这一百分比率随着MTX梯度浓度的提高而出现浓度依赖性下降。 结论:骨肉瘤Saos-2细胞系中的CD133+群细胞具有少量、处于静止期、分化增殖潜能特点,并表达干细胞关键调控基因及耐药相关基因等肿瘤干细胞的特征,我们称其为“类肿瘤干细胞”。DAYS可有效下调P-gp(MDR1)的表达并逆转耐药,是有应用潜力的逆转骨肉瘤P-gp介导多药耐药的逆转剂。经过DATS逆转耐药后的Saos-2/R中的类肿瘤干细胞---CD133+群细胞---无法耐受MTX的作用,而出现浓度依赖性百分率降低,我们推断DATS逆转耐药同时,可能具有逆转类肿瘤干细胞耐药的作用,使得类肿瘤干细胞对MTX的耐受性下降而出现细胞比例下降。


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