乙肝疫苗使用20年后山东省乙型病毒性肝炎血清和分子流行病学研究

【摘要】： 【背景】乙型病毒性肝炎(以下称乙肝)是由乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的以肝脏损害为主的传染病,可发展成为慢性肝病、肝硬化和肝癌,是我国重要的公共卫生问题。多年来,山东省乙肝控制工作一直采取以“新生儿乙肝疫苗(Hepatitis B vaccine,HepB)接种”为主的策略;1987年开始引入HepB,1992年开始在新生儿普及接种,但需自费接种;2002年将HepB纳入儿童计划免疫,免费为新生儿提供HepB,仅收取少量注射费用;2005年开始新生儿接种HepB完全免费。山东省还于2004年和2006年分别开展了学龄前儿童和15岁以下儿童HepB查漏补种工作,同时在成人中积极推广使用HepB。山东省曾于1992年新生儿普种HepB初期开展了全省乙肝血清学调查,HBV流行率高达50.00%,人群慢性乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带率为6.4%,其中儿童HBV流行率和慢性HBsAg携带率分别为45.63%和8.00%,此后未再开展全省大样本调查工作。HepB的长期、广泛使用可能对人群HBV的流行强度和流行特征产生影响。为了解HepB接种20年后山东省HBV血清流行病学和分子流行病学现状及特征,于2006年9月开展本研究。 【研究目的】了解HepB使用20年后山东省社区人群HBV血清学指标流行率、分布特征、感染模式构成以及青少和成人HBV感染的主要危险因素;与新生儿普种HepB初期比较,探讨山东省乙肝流行病学特征的变化趋势,对防治效果进行初步评价。了解山东省社区人群中HBV基因型、血清学业型、HBV S基因变异株和HBV隐匿性感染(Occult hepatitis B viruS infection,OBI)的流行状况、分布特点以及病毒株的分子生物学特点,为完善乙肝控制策略提供参考。 第一部分乙型病毒性肝炎血清流行病学研究 【材料与方法】根据人群HepB免疫策略调整情况,将研究对象分为新生儿普种HepB前出生(15～59岁)、新生儿HepB自费接种时期出生(5～14岁)和HepB计划免疫时期出生(1～4岁)3个年龄组,分别计算样本量;通过多阶段随机抽样在山东省12个县(市、区)随机抽取1～59岁调查对象7601人。对所有调查对象进行问卷调查和血标本采集;使用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)方法,检测调查对象血清HBsAg、乙肝病毒表面抗体(Antibody to HBsAg,Anti-HBs)、乙肝病毒核心抗体(Antibody to core antigen,Anti-HBc),HBsAg阳性者进一步检测乙肝病毒e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)和乙肝病毒e抗体(Antibody to hepatitis B e antigen,Anti-HBe)。采用抽样权重对不同地区、不同人群HepB接种率,HBsAg、Anti-HBs流行率,HBV流行率和HBV易感率进行点值估计,采用泰勒级数线性法估计率的方差,然后构建点值估计的置信区间,通过比较置信区间进行率的统计学检验;计算调查人群和育龄期妇女中不同HBV血清学感染模式构成比;以以上调查中青少年和成人HBV感染者为病例组,非HBV感染者为对照组,以调查问卷中HBV感染可能相关因素作为备选变量,采取成组病例对照研究方法,通过单因素和多因素非条件logistic回归分析,筛选出HBV感染危险因素,计算各危险因素的比值比(OR值)和人群归因危险度百分数(Population attributable risk percent,PARP)。 【结果与分析】 (1)人群HepB接种情况。山东省1～59岁人群HepB全程接种率为27.07%(95%CI=22.56%～31.59%),1～4岁人群HepB全程接种率(99.66%)显著高于5～14岁(89.95%)和15～59岁人群(13.21%);10～14岁人群HepB全程接种率(81.22%)显著低于10岁以下各年龄组(均＞97%)。全省1～14岁人群首针HepB(First dose of hepatitis B,HepB_1)及时接种率为65.41%(95%CI=55.56%～75.25%);1岁组HepB_1及时接种率(93.07%)显著高于8岁以上各年龄组(＜75%),城市地区HepB_1及时接种率(86.20%)显著高于农村地区(61.92%);在家出生者(23.67%)显著低于在乡镇级(70.70%)和县级以上医院(75.17%)出生者。 (2)HBV血清学指标流行率和分布特征。全省1～59岁人群HBsAg流行率为3.39%(95%CI=2.51%～4.26%),15～59岁人群HBsAg流行率(3.81%)显著高于1～4岁(0.92%)和5～14岁(1.53%)人群;东、中、西部和城乡之间,以及不同性别人群之间HBsAg流行率无显著差异;与新生儿普及HepB初期相比,1～59岁人群HBsAg流行率下降47.03%,而1～4岁和5～14岁儿童分别下降88.38%和80.95%。全省1～59岁人群Anti-HBs流行率为44.96%(95%CI=41.34%～48.57%),15～59岁人群Anti-HBs流行率(40.04%)显著低于1～4岁(72.14%)和5～14岁(66.71%)人群;不同地区和不同性别人群Anti-HBs流行率无显著差别;与新生儿普及HepB初期相比,1～59岁人群Anti-HBs流行率上升99.82%,1～4岁和5～14岁儿童分别上升2.97和2.44倍。全省1～59岁人群HBV流行率为24.26%(95%CI=21.94%～26.57%),15～59岁人群HBV流行率(28.46%)显著高于1～4岁(2.18%)和5～14岁(5.18%)人群;城市地区HBV流行率(34.38%)显著高于农村地区(22.43%);与新生儿普及HepB初期相比,仝人群HBV流行率下降51.48%,1～4岁和5～14岁儿童分别下降94.95%和88.83%。全省1～59岁人群中HBV易感率为48.25%(95%CI=45.05%～51.46%),其中15～59岁人群HBV易感率(52.07%)显著高于1～4岁(26.79%)和5～14岁(31.51%)人群;农村地区人群HBV易感率(49.65%)显著高于城市地区(40.53%)。 (3)不同HepB免疫史人群HBV流行率。有HepB免疫史人群Anti-HBs流行率(65.51%)显著高于无免疫史(33.06%)和免疫史不详(38.77%)人群,HBV流行率(14.34%)显著低于无免疫史(29.96%)和免疫史不详(27.52%)人群;未发现不同HepB免疫史人群HBsAg流行率存在显著差别。在婴儿期完成3剂次HepB的1～14岁人群中,10～14岁组人群HBV流行率(8.76%)显著高于10岁以下人群(＜3%)。 (4)HBV血清学指标检出模式。调查对象共检出10种HBV血清学指标组合模式,其中第8种感染模式(即Anti-HBs单阳性)检出率最高,占调查对象的43.69%;第10种感染模式(即乙肝血清学五项指标全阴者)次之,占调查对象的37.68%;不同年龄、HepB免疫史人群HBV血清学感染模式不同。育龄期妇女(20～49岁)中共检出9种感染模式,其中第10种模式所占比例最高,为51.38%;其次为第7种(Anti-HBc和Anti-HBs同时阳性)和第8种模式,分别占22.34%和18.07%,以上3种模式合计占调查育龄期妇女的91.79%;第4种和第6种(即HBsAg和HBeAg双阳性)占调查育龄期妇女的1.58%。 (5)青少年及成人HBV感染危险因素分析。15～59岁人群HBV感染的主要危险因素按照OR值大小依次为:长期一起生活的人HBAg阳性、年龄≥30岁、有针灸史、男性和乙肝疫苗接种史(为保护因素)其OR值分别为2.00,1.57,1.31,1.20,0.78;其人群归因危险百分比(PARP)分别为2.01%、30.27%、2.43%,7.70%和6.48%。 【结论】山东省目前仍为乙肝中度流行区,青少年和成人中HBV流行强度显著高于儿童,不同地区间流行差异依然存在。与新生儿普种HepB初期相比,山东省HBV流行强度减弱,儿童时期流行高峰消失;人群特别是儿童HBV免疫水平明显提高,山东省实施以“新生儿HepB接种”为主的乙肝控制策略取得了显著成效。目前山东省社区人群特别是成人中仍有大量HBV易感人群,应进一步加强乙肝控制工作。 【创新点】首次对山东省HepB使用20年后乙肝血清学流行状况开展全省范围大样本研究。研究内容系统全面,设计实施科学严谨,分析方法具有创新,研究结论翔实可靠,为进一步加强山东省乙肝控制工作提供了科学的依据。 第二部分乙型病毒性肝炎分子流行病学研究 【材料与方法】从本研究第一部分乙肝血清学研究保留的HBsAg阳性血清标本中提取总核酸(DNA),采取巢氏聚合酶链反应(Nested polymerase chainreaction,Nested-PCR)方法扩增HBV S基因区,对扩增产物进行双向测序;用BioEdit Sequence Alignment Editor software 5.0.9软件进行核苷酸序列排列;用MEGA 3.1软件按照邻接法(Neighbor-joining)构建系统发生树(Phylogenetictree),在进化树上靠近的标准株基因型即为该标本病毒株的基因型。使用MEGA3.1软件将核苷酸序列翻译成氨基酸联排序列并进行序列比较,根据S基因中122位、160位、127位、134位、159位、177位和178位氨基酸种类确定HBV血清学亚型,通过氨基酸序列比较确定S基因变异位点。计算不同地区和人群各HBV基因型和血清型的构成比;分析HBV S基因变异株变异位点、变异形式和检出率;利用χ~2检验或Fisher's精确概率法,对不同地区、不同年龄、性别、HepB免疫史和血清学感染模式人群“α”抗原决定簇变异株检出率的差异进行统计学检验。按照系统抽样方法,从HBV血清学研究保留的HBsAg阴性血清标本中随机抽取485份,提取总DNA,使用Nested-PCR方法扩增HBV S基因和C基因,两次扩增两基因均为阳性者确定为OBI;利用以上相同方法确定OBI病毒株的基因型、血清型和S基因、C基因变异情况;计算不同地区、不同年龄、性别和血清学感染模式人群OBI检出率,利用χ~2检验或Fisher's精确概率法对OBI检出率差异进行统计学检验。 【结果与分析】 (1)基因型和血清型分布。对102份HBsAg阳性血清标本进行了基因型、血清学亚型和HBV S基因变异的检测。检出B型和C型两种基因型,其中99.02%(101/102)为C基因型且全部为C2亚型,仅1株为B基因型B2亚型;检出adrq+、adw2和ayr 3种血清型,其中adrq+型占96.08%(98/102),adw2型占2.94%(3/102),ayr型占0.98%(1/102);3株adw2血清型和1株ayr血清型毒株均来自山东省中部地区。 (2)S基因变异株流行情况。102株HBV中共检出15株“α”抗原决定簇变异株病毒,变异株检出率为14.70%(15/102);检出11个“α”抗原决定簇aa位点的13种突变形式,其中9种突变形式既往有文献报道,包括I126S、I126N、P127T、Q129L、G130R、M133T、F134S、P142S和G145R;4种突变形式既往未见文献报道,包括P135S、P135L、C137L和S143T;15株“α”抗原决定簇变异病毒株除4株发生I126S变异,各有2株发生P127T变异和G145R变异外,其余变异形式均仅在1株病毒中检出;不同地区和不同年龄、性别、HepB免疫史人群间“α”抗原决定簇变异株检出率均无显著性差异。102株病毒中,43.14%被检测出前S区变异,21.57%发生在前S1区,15.69%(16/102)发生在前S2区,5.88%同时发生在前S1和前S2区;尤以前S1区的前端突变较为集中。 (3)隐匿性乙肝病毒感染(OBI)检出率及分布情况。485份HBsAg阴性标本中4份检出OBI,检出率为0.82%;不同HBV血清学指标人群中OBI的检出率有显著差别。OBI毒株均为C基因型、adrq+血清学亚型;2例(0.41%)出现“α”抗原决定簇变异(1例为G145R突变,1例为S143T突变),2例出现“α”抗原决定簇以外突变(均为T47K突变)。 【结论】山东省社区人群中HBV以C型基因、adrq+血清型为主;少量的adw2和ayr血清型主要集中在中部地区;社区人群中HBV S基因变异株的发生率较低,变异位点比较分散,野毒株仍是优势毒株;aa126点是HBV“α”抗原决定簇最常见的变异位点。山东省社区人群中OBI检出率较低;其检出率与HBV血清学感染指标有关。 【创新点】本研究首次从无症状HBV携带者中证实C基因型和adrq+血清型在山东省HBV流行的优势地位。在国内首次从有代表性的社区人群中对S基因变异株特别是“α”抗原决定簇变异株的流行率、分布特征和分子生物学特点进行研究,发现了4种新的“α”抗原决定簇变异形式。本研究是国内近20年来首次在社区人群中开展的OBI流行现状研究。