高危型人乳头瘤病毒早期蛋白E6和E7调控细胞周期的机制研究

【摘要】： 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是小双链DNA病毒,基因组长约8kb,该病毒具有高度的嗜上皮性和组织特异性。目前已经发现150多种HPV型别,其中感染生殖道的HPV根据其致病性,可分为低危型HPV和高危型HPV。低危型如HPV6,11等可引起尖锐湿疣等良性病变,而高危型如HPV16,18等可诱导宫颈癌等癌症的发生。 流行病学研究表明,HPV16和HPV18诱发的宫颈癌占所有HPV阳性宫颈癌的70%左右,其中HPV16感染在全球具有明显主导作用,具有致癌危险性的除了HPV16和HPV18以外,还有31,33,45与58型等,其中58型人乳头瘤病毒的流行具有明显的地区特异性,HPV58是亚洲地区引发宫颈癌的第三大HPV型别,仅次于HPV16,18。HPV58在中国女性宫颈癌标本中的检出阳性率非常高,尤其是中国南部城市和台湾、香港等地,HPV58型的检出率仅次于HPV16型,同时二者在宫颈各病变组的检出强度趋势基本一致。 人乳头瘤病毒基因组可分为三个区：非编码区,编码7个早期基因的早期区和编码2个晚期基因的晚期。高危型HPV的致癌性主要依赖于早期蛋白E6和E7,其中E6结合并通过泛素途径降解p53,而E7降解Rb蛋白,释放Rb/E2F复合物中的转录因子E2F,E2F激活细胞合成所需蛋白的转录,从而引起细胞增殖的紊乱。我们的研究发现：(一)HPV16E6还具备不依赖降解p53之外的其它功能,其在不降解p53的前提下,通过逃避有丝分裂后检测点诱导多倍体的产生,而多倍体是宫颈癌发生的重要早期事件；(二)我们首次在原代角化上皮细胞(primary human keratinocytes, PHKs)中研究了HPV58E7的分子生物学活性,结果发现其能降解Rb蛋白,并逃避抑制因子p21的抑制作用而激活细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, Cdk) 2,从而促进细胞的增殖；(三)我们首次研究干扰素诱导蛋白(interferon-inducible protein, IFI)16在宫颈癌中的作用,发现其能抑制宫颈癌细胞的生长增殖并抑制裸鼠体内宫颈癌细胞所诱导的肿瘤生长,证实其可能是一种潜在的宫颈癌抑癌蛋白。 一.HPV16 E6诱导多倍体的机制研究 基因组不稳定是癌症发生发展的标志之一。细胞含有两套以上染色体即多倍体细胞在肿瘤的发展中具有重要意义。在许多癌症中,多倍体是癌症发生的早期事件,因为多倍的染色体将产生多极纺锤体,而之后的随机分离将会产生异倍体。研究发现,在宫颈癌的早期能检测到许多多倍体及异倍体细胞的存在,因此阐明HPV诱导多倍体的机制具有重要的现实意义。 高危型人乳头瘤病毒E6结合并通过泛素途径降解p53是其致癌的主要原因,有报道称HPV16E6通过逃避纺锤体聚集检测点(spindle assembly checkpoint),诱导多倍体的产生,并且此功能依赖于E6降解p53,然而我们的实验证实16E6在不降解p53的前提下,也能诱导多倍体,并且16E6并没有影响纺锤体聚集检测点,而是通过逃避有丝分裂后检测点(post-mitotic checkpoint)实现的。 1.为了明确16E6诱导多倍体是否依赖于其降解p53的功能,我们首先构建了pBabe-HPV16E6及不能降解p53的16E6突变体pBabe-F2V,利用逆转录病毒包装系统包装质粒,获得高滴度病毒颗粒,感染永生化的角化上皮细胞NIKS,嘌呤霉素筛选得到稳定细胞系,Western blot鉴定16E6及F2V的功能性表达。我们用微管破坏药物nocodazole处理细胞,48h后观察发现42%的PHK/16E6细胞变为多倍体细胞,而20%的PHK/F2V也成为多倍体细胞,由于F2V不降解p53,说明16E6诱导多倍体的产生并不全是依赖降解p53实现的。 2.用nocodazole处理细胞后,因为微管被破坏,纺锤体检测点被激活。细胞首先经历纺锤体检测点的检测,然而我们的前期研究发现,细胞并没有停滞在M期,而是逐渐适应这一过程,最后滑移到下一期-类G1期,由于此期存在有丝分裂后检测点,空载体细胞将停滞在此期,而不会产生多倍体细胞,而NIKS/16E6及NIKS/F2V则可绕过这一检测点,产生多倍体细胞。目前对有丝分裂后检测点的认识尚不清晰,因为细胞最终通过细胞周期蛋白依赖性激酶的作用完成各个细胞期,因此我们认为NIKS/16E6及NIKS/F2V很可能通过激活某种Cdks顺利通过此期,进入合成期产生多倍体细胞。为了验证这一设想,我们首先检测了细胞中一系列细胞周期蛋白及蛋白依赖激酶的表达水平,结果表明Cdk1及Cdk2的表达显著升高。 3.在细胞周期中,Cdks的水平一般处于多余水平,只有Cdks与相应的cyclins结合并磷酸化后,才具有激酶的活性,因此我们检测了各种Cdks及cyclins的酶活性,结果证明Cdk1和Cdk2的活性都是升高的,说明Cdk1、Cdk2是推动16E6表达细胞逃避有丝分裂后检测点,并产生多倍体细胞的决定因子。 以上研究打破了现存的理论观点,阐明了16E6不依赖降解p53之外的功能,丰富了16E6的致癌机制,同时进一步拓宽了对有丝分裂后细胞周期检测点的认识,为今后的临床治疗奠定了基础。 二.HPV58E7致癌的分子机制研究 人们对高危型HPV的研究主要集中在HPV16,18上,而对其它高危型HPV的研究较少。HPV58在亚洲地区包括中国在内的宫颈癌中具有较高的检出率,至今却没有对其转化蛋白E7的生物活性的分子研究。 1.我们首先利用分子克隆技术构建质粒pBabe-HPV58E7和pBabe-58E7-HA (haemagglutinin, HA)。为了更接近人体的自然感染状态,我们采用原代角化上皮细胞-HPV感染的天然宿主细胞为靶细胞,利用逆转录病毒包装系统获得表达58E7的细胞系。RT-PCR确定58E7在mRNA水平的表达,对HA的Western Blot检测确定了HA在蛋白水平的表达,间接证实58E7的表达。细胞培养发现,与感染空载体的细胞相比,PHK/58E7细胞增殖显著加快,并且空载体原代角化细胞PHK/vector在第5代老化死亡,而PHK/58E7可生长至20代以上,实现了细胞永生化。 2.细胞周期依赖蛋白激酶是推动细胞进程、促进细胞增殖的关键,而在一系列激酶中尤其以G1期相关激酶最为重要,因此我们检测了G1期相关激酶Cdk2及其催化亚基cyclin A和cyclin E的表达水平,结果显示PHK/58E7中Cdk2及cyclin A和cyclin E的表达显著上调,同时激酶活性分析证实Cdk2的活性明显提高。p53作为抑癌蛋白,在一半以上的癌症中缺失或者突变。p53的功能主要是通过激活p21实现的,p21作为细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs),可以抑制激酶Cdk2的活性从而阻断细胞周期的进程。我们在检测Cdk2的同时,检测了p53和p21的蛋白表达水平,结果表明PHK/58E7中,p53和p21的水平也显著升高,结合之前测定Cdk2具有较高的活性,说明58E7能逃避或者干扰p21的抑制功能,激活Cdk2,从而使细胞增殖。 3.细胞周期分为G1,S,G2和M四期,在各期分别存在对应的细胞周期检测点,当细胞遭遇紫外线照射等DNA损伤时,检测点激活,细胞周期暂时停滞,直至修复完成才进入下一周期。已知16E7能逃避G1期检测点,为了验证58E7是否能影响G1检测点,我们用DNA破坏物质bleomycin处理细胞,结果发现药物处理后,更多的空载体细胞停滞在G1期,进入S期的细胞减少,说明DNA损伤激活了G1检测点,使细胞停滞在G1期；而PHK/58E7则能逃避G1检测点,使更多的细胞进入S期。多倍体是癌症发生的早期事件,因此我们用nocodazole处理细胞,发现空载体细胞大多停滞在G2期,不会产生多倍体细胞,而PHK/58E7细胞则形成多倍体细胞。以上实验说明虽然不如16E7作用显著,但58E7与16E7类似,可以绕过细胞周期检测点并诱导多倍体的产生,而多倍体对癌症的发生具有重要意义。 4.高危型HPVE7可以降解Rb蛋白,我们因此检测58E7能否降解pRb及其家族产物p130和p107。尽管不如16E7降解效果显著,但58E7可降解大部分pRb,且降解的主要是非磷酸化形式即活性形式的Rb蛋白。在我们的培养条件下,58E7不能降解p107,但有意义的是,58E7能比16E7更有效地降解p130。由于p130可能通过参与非端粒酶延长机制(alternative lengthening of telomere, ALT)维持端粒长度,而HPV58E7可高效降解p130,我们认为HPV58E7可能通过降解p130,维持端粒长度而实现细胞永生化。 本部分的工作是世界首次对高危型HPV58E7致癌的分子机制进行研究,可为发现治疗性靶位或者研制治疗性疫苗提供理论基础。 三.IFI16抗HPV感染致宫颈癌的作用及机制探讨 干扰素是一类具有调节细胞生长和分化、抗肿瘤及抗病毒等众多生物学功能的小分子蛋白质,干扰素诱导蛋白(interferon-inducible proteins)是干扰素抗肿瘤抗病毒等众多生物学功能的执行者。其中p200蛋白家族是干扰素诱导产生的众多蛋白质的一类,而IFI16是p200家族的人源蛋白之一。 1.我们首先检测了IFI16在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达,发现IFI16在宫颈癌中的表达显著下调。为了进一步研究IFI16在肿瘤形成过程中的作用,我们首先在宫颈癌细胞系SiHa中过表达IFI16,进行细胞增殖实验分析。MTT分析、细胞生长曲线表明过表达IFI16明显降低细胞的生长率,流式细胞术表明进入合成期细胞减少,β-细胞半乳糖苷酶分析显示细胞衰老率增加。体外裸鼠肿瘤形成试验表明在宫颈癌细胞SiHa中过表达IFI16后,细胞的致瘤性降低,裸鼠体内形成的肿瘤明显缩小。 2.另一方面我们利用RNAi(RNA interfere)技术构建能有效降低细胞内源性IFI16表达的质粒pSUPER-IFI16,将其转染HPV永生化的H8细胞建立稳定细胞系。转染pSUPER-IFI16的H8细胞细胞分裂增殖加快；同时进入合成期的细胞增加。将稳定转染pSUPER-IFI16的细胞分别皮下注射裸鼠,裸鼠体内肿瘤形成的情况表明,注射对照细胞的裸鼠体内没有肿瘤形成；而当抑制IFI16表达,永生化细胞H8获得了恶性转化能力,注射稳定转染pSUPER-IFI16细胞的6只裸鼠体内均长出肿瘤。 3.为了进一步探讨IFI16影响宫颈癌的机制,我们分别研究了其对癌基因HPV16E6、16E7、myb、c-myc、抑癌基因Rb、p53,以及凋亡相关基因caspase3、caspase8的表达的影响。过表达IFI16后,我们发现HPV16E6、16E7、myb、c-myc、caspase3、caspase8基因的mRNA表达均下调,而抑癌基因pRb和p53的mRNA表达则显著增加。 我们首次在细胞水平及动物水平系统地研究了IFI16对宫颈癌的抑制作用,提示IFI16可以作为一种HPV相关疾病的治疗靶位应用于临床,为将来宫颈癌等恶性肿瘤的治疗提供了新思路,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。