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原癌基因C-met基因在食管鳞癌中的表达及其与COX-2表达相关性以及COX-2基因表达与细胞增殖、凋亡相关性研究

朱晓峰  
【摘要】: 原癌基因C-met在食管鳞癌中的表达及其与COX-2表达相关性以及COX-2基因表达与细胞增殖、凋亡相关性研究 目的 食管癌是消化道常见恶性肿瘤之一,其发病过程中存在许多原癌基因的激活。C-met是一种由C-met原癌基因编码的蛋白产物,为肝细胞生长因子受体,具有酪氨酸激酶活性,与多种癌基因产物和调节蛋白相关,参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控,是细胞增殖、分化和运动的重要因素。目前研究表明,C-met基因与多种恶性肿瘤的发生和转移密切相关,许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有C-met的过度表达和基因扩增。 当前国内外文献食管鳞癌中C-met表达情况报道较少,因此,本实验通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription -polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测57例食管鳞癌组织和20例癌旁正常食管组织中C-met mRNA的表达,并分析C-met mRNA的表达与临床病理资料之间的关系;同时采用免疫组织化学方法检测了57例食管鳞癌组织和20例癌旁正常食管组织中C-met蛋白及COX-2蛋白的表达,并探讨C-met蛋白与COX-2蛋白之间的关系。本研究还应用流式细胞术,对食管鳞癌细胞的增殖活性和凋亡水平进行检验分析,希望证实COX-2表达与食管肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。 材料与方法 一、实验材料 57例食管鳞癌手术标本及部分相应的癌旁正常食管组织标本20例来自山东大学省立医院胸外科2008年11月-2009年12月间的手术病例,其中男性46例,女性11例,年龄34~72岁,中位年龄52.9岁。57例肿瘤组织中,13例低分化,28例中分化,16例高分化,26例有淋巴结转移。肿瘤部位中段28例,下段29例。肿瘤大小≤5cm32例,5cm25例。根据国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的食管癌临床分期标准,Ⅱa期31例,Ⅱb+Ⅲ期26例,食管上段、T4及M1(Ⅳ期)病人不包括在手术范围内。胸腹部淋巴结清扫范围参照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)食管癌淋巴结分布图,淋巴结清扫数目7-22枚,平均9.6枚。所有患者术中肉眼大体判断均达RO切除,术后病理诊断食管鳞癌,食管上、下切缘均无肿瘤细胞残留。相应的癌旁正常食管组织标本为术中采集距离食管癌组织至少5cm以上的正常食管组织。所有患者术前均未行放、化疗治疗。 二、实验方法 1、逆转录PCR检测C-met基因表达 取100mg待检验组织,加入1ml Trizol溶液彻底匀浆。参照Trizol试剂盒说明书用一步法提取总RNA,用DNA/RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。反应体系中加入10×RNA PCR Buffer 1μl、dNTP 1μl、MgCl2 2μl、Random 9mers 0.5μl、RNA 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、Reverse Transcriptase 0.5μl、ddH2O 3.75μl。反应条件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。 C-met基因引物序列为5' - TTCACCGCGGAAACACCCATC -3'(上游)和5’-GTCTTCCAGCCAGGCCCAGT -3'(下游)。在12.5μ1反应体系中含有灭菌ddH2O 7.16μl、20pmol/L上、下游引物各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs 0.04μl、5×Buffer 2.5μl。反应条件:95℃2min,95℃1min,58℃1min,72℃1min,30个循环;72℃延伸7min。用内参照β-肌动蛋白(β-actin)检测逆转录效率。PCR产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,100V,1.5h,电泳结束后,凝胶自动成像仪进行摄像分析。采用TaKaRa公司100bp梯度Makers为分子量大小对照,确定电泳条带。 2、免疫组织化学方法检测C-met、COX-2蛋白表达 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(Streptavidin-peroxidase S-P)免疫组织化学方法,一抗C-met和COX-2兔抗人多克隆抗体(美国BIOCHEMICALS公司产品),工作浓度1:100,S-P试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。胞浆染色为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志,将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级:弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)。 3、流式细胞术检测食管鳞癌细胞的增殖活性和凋亡水平 取材深低温保存的组织,采用网挫方法制备单细胞悬液,以PBS调整细胞数为1×106/m1。其中一份加入PI染色液lml(PI染色液包含PI 5mg, Rnase 2mg, TritonX-100ml,生理盐水65m1,枸椽酸钠100mg,加蒸馏水至100m1),置4℃冰箱中避光染色30min后进行分析。另一份加入FITC-AnnexinV及PI各5μ1,室温下避光静置15min后进行分析。 使用的流式细胞仪为FACSCalibur型(B.D,USA)。光源为488nm氩离子激光器,FITC受激发后发绿色荧光,PI发红色荧光,每份标本计数10000个细胞,然后在Macintosh 9.5计算机上用相关软件分析数据。测量前,以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的CV值在3.0%以内。应用MetaMorph (CellQuest3.0)细胞周期分析软件,计算DNA组方图各时相分布的百分比,以增殖指数(proliferation index, PI)表示增殖活性。二维点阵图上FITC高染而PI低染者为早期凋亡细胞,计算其所占的百分比。 三、统计学分析 计数资料采用X2检验,计量资料采用t检验,用SPSS13.0软件处理。 结果 1、C-met基因在食管鳞癌组织中的表达情况 C-met基因在57例食管鳞癌组织中阳性表达率为52.6%(30/57),而在20例癌旁正常食管组织中低表达,阳性率为5.0%(1/20),两者之间有显著性差异(P0.01)。 2、C-met基因的表达与食管鳞癌组织临床病理资料的关系 C-met基因的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关(PO.05),而与鳞癌组织浸润深度(P0.05)、淋巴结转移和TNM分期有关(P0.01)。 3、食管鳞癌组织中C-met蛋白表达与COX-2蛋白表达的相关性 C-met蛋白在57例食管鳞癌组织中阳性表达率为52.6%(30/57),而在20例癌旁正常食管组织中低表达,阳性率为5.0%(1/20),两者之间有显著性差异(P0.01)。在食管鳞癌组织中,C-met蛋白的表达与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关,而与患者年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关(P0.05)。 COX-2蛋白在57例食管鳞癌组织中有40例阳性表达(阳性率为70.2%),而20例癌旁正常组织仅1例呈阳性表达(阳性率为5.0%),两者之间有显著性差异(P0.01)。在食管鳞癌组织中,COX-2蛋白的表达与淋巴结转移和TNM分期有关(P0.05),而与患者年龄、性别、病变长度、癌组织浸润深度和组织分化程度无关(P0.05)。 30例C-met蛋白表达阳性的食管鳞癌组织中有26例COX-2蛋白阳性表达,27例C-met蛋白表达阴性的食管鳞癌组织中有14例COX-2蛋白呈阳性表达,经统计学检验分析,C-met蛋白表达与COX-2蛋白表达呈正相关(r=0.436,χ2=8.203,P=0.004)。 4、食管鳞癌组织中COX-2基因表达与肿瘤细胞增殖的相关性 通过免疫组织化学方法检测的57例食管鳞癌组织的细胞增殖指数(PI)平均为(30.14±4.99)%。57例患者中40例COX-2蛋白阳性表达,17例COX-2蛋白阴性表达,食管鳞癌细胞增殖指数(PI)分别为(31.41±5.14)%和(27.15±4.66)%,两者比较有显著性差异(t=6.933,p0.01)。 5、食管鳞癌组织中COX-2基因表达与肿瘤细胞早期凋亡的相关性 通过免疫组织化学方法检测的57例食管鳞癌组织的早期凋亡率平均为(2.18±0.78)%。57例患者中40例COX-2蛋白阳性表达,17例COX-2蛋白阴性表达,食管鳞癌细胞早期凋亡率分别为(1.97±0.71)%和(2.66±0.94)%,两者比较有显著性差异(t=4.831,,p0.01)。 结论 1、C-met基因在食管鳞癌中呈高表达,而在癌旁正常食管组织中低表达。 2、C-met基因的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、病变长度和癌组织分化程度无关,而与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关。 3、COX-2基因在食管鳞癌中呈高表达,而在癌旁正常食管组织中低表达。 4、COX-2基因的表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、病变长度、癌组织浸润深度和组织分化程度无关,而与淋巴结转移和TNM分期有关。 5、食管鳞癌组织中C-met蛋白表达与COX-2蛋白表达密切相关。 6、食管鳞癌组织COX-2基因表达与肿瘤细胞增殖有关。 7、食管鳞癌组织COX-2基因表达与肿瘤细胞早期凋亡有关。


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