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大蒜素和两性霉素B联合抑制白念菌丝形成的初步研究

王晓燕  
【摘要】: 目的 白色念珠菌(Candida albicans)是一类重要的条件致病性真菌,能够引起免疫抑制病人的一系列感染。近年来,白色念珠菌感染日益增多,随着抗真菌药物的广泛应用,药物副作用及白色念珠菌耐药问题成为临床白色念珠菌病防治极具挑战性的课题。联合应用不同作用机制的抗真菌药物以减少药物的副作用,避免耐药性产生,是治疗真菌感染的一个重要的研究方向。两性霉素B(amphotericinB, AMB)耐药率最低,抗菌谱广,是许多深部真菌感染的首选药物,但其不良反应多且严重。寻找一种副作用少,能够协同AMB的抗真菌作用的药物具有重要的临床价值。近年来,大蒜素抗真菌作用已经为国内外学者所研究,但其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)较高,限制了其临床应用。 作为二相型真菌,形态转换是白色念珠菌一个重要的毒力因子,菌丝相是体内主要的致病形式,研究发现白色念珠菌菌丝形成与其它毒力因子如粘附相关因子,分泌性蛋白酶之间存在密切关系。调节菌丝形成的信号通路同时调节粘附相关因子及侵入酶的表达,菌丝形成的同时这些毒力因子表达随之升高,因此菌丝形成是白念致病的关键环节,若能抑制白色念珠菌菌丝的形成,就能控制其感染。 在本实验中,用微量稀释法测定了大蒜素与AMB联用的体外抗白念效果,以部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concenitration index, FICI)来评价两者联合效果。10%小牛血清-RPMI1640诱导菌丝形成,检测大蒜素与AMB及其两者联用时对白念形态发育变化的影响,检测RNA水平上两药联合时菌丝特异性基因的抑制作用。细胞形态观察及MTT法检测联合用药后对Hep-2及H8细胞毒性的变化。 建立白色念珠菌系统性感染的动物模型,观察联合用药后小鼠整体状况变化,脾肝内菌负荷量及菌丝形成情况。通过细胞及动物水平验证两药联合抗白念作用及抑制菌丝形成作用,为临床上联合应用两药提供有力的理论依据。 方法 1、细胞水平大蒜素和AMB联合抗白念作用及细胞毒性作用: (1)两药联合作用评价:微量稀释法测定单药应用及联合应用对白色念珠菌的MIC,以FICI法对联合应用效果进行评价。 (2)药物对白念菌丝形成的抑制:以10%小牛血清—RPMI 1640诱导菌丝形成,单用大蒜素,AMB及两药联用作用于白念,2h时观察芽管形成率,3h时观察菌丝形成情况并拍照。并在3h时提取各组药物作用下白色念珠菌总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增菌丝特异性基因ECE1、HWP1后琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果并拍照。 (3)细胞形态及MTT法检测两药联合应用后对Hep-2及H8细胞毒性变化:单用大蒜素,AMB及两药联用作用于Hep-2及H8细胞,48h后观察细胞形态,并在48h时用MTT法检测各组药物作用下细胞活性,即在490nm波长下检测各组细胞光密度值(OD值),计算出各组均值、细胞相对生存率(RSR) 2、动物水平大蒜素和AMB联合抗白念作用及抑制菌丝形成作用: 雄性昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺,而后腹腔注射白色念珠菌,建立系统性白色念珠菌感染动物模型,单用大蒜素,AMB及联合应用两药,观察小鼠整体状态变化,5天后处死小鼠,留取脾肝,一部分计数CFU/g。脾肝另一部分作组织切片,进行PAS染色观察脏器中白色念珠菌菌丝形成情况。 结果 1、细胞水平大蒜素和AMB联合抗白念作用及细胞毒性作用结果: (1)两药联合抗白念作用表现为协同作用,两药联用后,各自的MIC值降低。 (2)两药联用与大蒜素,AMB相比,2h时芽管形成率均有显著统计学意义(P0.05),两药联合可降低芽管形成率。两药联合3h时可完全抑制菌丝形成,菌丝特异性基因ECE1、HWP1表达受到明显抑制,与单药相比有显著差异。 (3)两药联用与单药相比,从细胞形态上观察,其药物毒性降低。在细胞生存率上,联合用药组与单药组均有显著统计学意义(P0.05) 2、动物水平大蒜素和AMB联合抗白念作用及抑制菌丝形成作用结果: (1)正常对照组小鼠活动良好,未见其他异常。感染组及单药组小鼠出现皮毛无光泽、活动减少等现象。两药联合组症状明显轻于感染组及单药组。 (2)两药联合组与感染组及单药组相比,脾肝中菌的CFU/g明显下降,均有统计学意义(P0.05)。 (3)PAS染色:感染组和单药组可见感染病灶中大量的菌丝形成,两药联合组菌丝形成明显减少。 结论 1、大蒜素与AMB联合应用抗白念作用表现为协同作用,两者联合应用后能够显著降低单药的浓度,从而降低药物对细胞的毒性作用。 2、大蒜素与AMB都具有抑制白念菌丝形成的作用,两者联合应用后能够增强各自抑制菌丝形成的能力,从而大大降低白念的致病能力。


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