Rb94增强A549细胞放射敏感性的体内研究

【摘要】： 目的： 视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, Rb)基因Rb94为全长型视网膜母细胞瘤基因N末端缺失112个氨基酸残基的剩余部分,编码分子量为94KD的抑癌蛋白,其与Rb110基因相比,具有更强的肿瘤抑制效应。前期研究已表明,Rb94基因转染人肺腺癌细胞系A549后可抑制鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1, SphKl)表达、增强鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase2, SphK2)表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、调控细胞周期,对A549细胞具有放射增敏作用。在前期体外实验的基础上,本研究构建Rb94基因转染裸鼠肺腺癌皮下移植瘤的动物模型,观察Rb94的抑瘤作用及对鞘氨醇激酶(SphK)表达的影响,进一步探讨SphK在抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等方面可能发挥的重要作用；进一步研究Rb94基因的放射增敏作用,探讨其作用机制,为以Rb94为靶点进行肿瘤放射增敏提供理论依据。 方法： 将由齐鲁医院中心实验室保存的空载体pIRES、质粒pIRES-Rb94分别转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,提取质粒,XhoI酶切鉴定后交由南京金思特有限公司进行大量提取,以供后续的动物实验应用。每只裸鼠皮下接种5×106数目的A549细胞,待肿瘤生长至180mm3大小时随机分为空白对照组、脂质体组、空载体组、转染Rb94基因组,各组又分为未照射组和照射组。各组裸鼠瘤体内分别注射0.01M磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)、脂质体(lipofectamine)、pIRES、pIRES-Rb94;照射组加照一定剂量X线。观察肿瘤生长情况并计算抑瘤率；采用实时RT-PCR和Western bolt法检测瘤组织中Rb94基因表达；实时RT-PCR和免疫荧光染色法观察Rb94基因对裸鼠肺腺癌皮下移植瘤中SphK表达的影响；Hoechst染色观察细胞凋亡情况；实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达；免疫组化SP法检测细胞周期阻滞。 结果： 转染Rb94基因组移植瘤被明显抑制,平均抑瘤率达51.99%,与空白对照组、空载体组、脂质体组(抑瘤率分别为0、7.86%、11.78%)相比差异有统计学意义(P0.01),而对照组间差异无统计学意义；联合治疗组抑瘤率为95.84%,与单独转染组或单独放射组相比,差异具有统计学意义(P0.01)；转染Rb94基因组移植瘤中Rb94基因在mRNA和蛋白水平表达增高；SphK1在mRNA和蛋白水平表达下调而SphK2表达上调；Hoechst染色法示转染组细胞凋亡增加；hTERT、Bcl-2 mRNA表达下降(三个对照组间相比,P0.05；转染组与对照组相比,P0.05)；免疫组化SP法示转染组G2／M期细胞阻滞(三个对照组间相比,P0.05；转染组与对照组相比,P0.05)。 结论： 成功构建了裸鼠皮下移植瘤模型；Rb94基因抑制SphKl的表达,增强SphK2的表达；Rb94基因对裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用,联合射线抑瘤效果更好,其放射增敏作用机制可能与Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达以及引起细胞凋亡、G2／M期周期阻滞、下调hTERT、Bcl-2 mRNA的表达有关,这就进一步从体内方面证实了Rb94基因对A549细胞的放射增敏作用,并为下一步研究提供理论依据。