收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Toll样受体介导角膜真菌感染炎症反应的作用及基因沉寂治疗研究

郭慧  
【摘要】: 第一部分: TLRs介导的角膜上皮细胞对烟曲霉菌的天然免疫反应 目的:研究角膜上皮细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4分别对配体刺激的免疫反应及其介导角膜上皮细胞对烟曲霉菌炎症反应的作用。 方法:培养永生化人角膜上皮细胞,利用TLR2配体酵母聚糖、TLR4配体LPS及烟曲霉菌菌丝分别刺激角膜上皮细胞,于不同时间点(1h,3h,6h,12h)收取培养上清进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子IL-1β和IL-6水平。分别设计靶向人TLR2、TLR4的siRNA序列,构建表达TLR2-或TLR4-siRNA的质粒,分别转染角膜上皮细胞,利用RT-PCR及Western blot检测TLR2、TLR4表达以评价抑制效果。利用烟曲霉菌菌丝并分别刺激转染siRNA的角膜上皮细胞及未转染对照细胞,于不同时间点(1h,3h,6h,12h)利用ELISA检测上清中细胞因子IL-1β和IL-6水平。 结果:TLR2配体酵母聚糖、TLR4配体LPS及烟曲霉菌均可刺激永生化人角膜上皮细胞(THCE)分泌炎性细胞因子IL-1β和IL-6。酵母聚糖刺激角膜上皮细胞后6h IL-1β和IL-6水平开始升高,并呈时间依赖性。LPS刺激后12h可见细胞因子显著性升高,但表达水平不如酵母聚糖刺激明显。烟曲霉菌刺激后3h细胞因子水平即明显升高,随刺激时间延长进一步上调。TLR2-或TLR4-siRNA贡粒转染角膜上皮细胞后,TLR2、TLR4 mRNA及蛋白水平表达均受到显著抑制。烟曲霉菌菌丝刺激后对照组IL-1β和IL-6表达明显上调,而TLR2-或TLR4-siRNA处理组IL-1β和IL-6水平均较对照组显著降低。 结论:TLR2配体和TLR4配体可诱导角膜上皮细胞的天然免疫反应;角膜上皮细胞通过TLR2和TLR4识别烟曲霉菌并介导炎性细胞因子表达。角膜上皮细胞表达的TLR2和TLR4在角膜抗真菌感染天然免疫中发挥重要作用。 第二部分: TLR2介导茄病镰刀菌诱导的人角膜基质细胞抗炎细胞因子表达 目的:研究TLR2在茄病镰刀菌诱导的人角膜基质细胞促炎细胞因子和抗炎细胞因子表达中的作用。 方法:设计靶向人TLR2 siRNA序列,连接入p-silencer 2.0 U6载体构建能表达TLR2-siRNA的质粒。分别转染永生化人角膜基质细胞,利用免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测TLR2的表达。制备茄病镰刀菌菌丝和孢子刺激液并分别刺激转染siRNA的角膜基质细胞及未转染对照细胞,刺激12h后利用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-1β和IL-10的表达。 结果:TLR2-siRNA质粒转染人角膜基质细胞后,TLR2 mRNA及蛋白水平表达均明显被抑制,mRNA抑制效率为60%,蛋白抑制效率可达65%左右。对照siRNA转染组、空载体组及空白对照组TLR2表达无显著差异。单纯镰刀菌菌丝和孢子均可刺激人角膜基质细胞IL-10和IL-1β表达明显上调,与对照组有显著差异(P0.01),其中菌丝刺激组细胞因子表达水平比孢子刺激组高。分别使用茄病镰刀菌菌丝及孢子刺激后,对照组IL-1β及IL-10的表达均明显上调,且菌丝诱导的表达上调比孢子更显著;RNA干扰组,IL-10表达较对照组明显降低,菌丝刺激组IL-10表达下调82%,孢子刺激组下调70%,与未干扰组表达水平比较均具有显著差异(PO.01);IL-1β的表达亦有降低,菌丝刺激组下调60%,孢子刺激组约下调54%,具有统计学差异,但不如IL-10下调显著。 结论:TLR2是人角膜基质细胞识别茄病镰刀菌的重要识别受体,它可能通过介导IL-10的表达发挥一种抗炎性作用。这将为探索角膜真菌感染发病机理和免疫防御反应机制提供新的思路。 第三部分: RNA干扰大鼠角膜TLR2表达对角膜真菌感染的影响 目的:研究RNA干扰大鼠角膜TLR2对角膜烟曲霉菌感染的影响。 方法:分别合成对照siRNA或TLR2siRNA,与转染试剂混合制备siRNA悬液,于感染前1天给予结膜下注射联合表面点眼。利用角膜接触镜法建立大鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,进行裂隙灯检查、临床评分及组织病理学分析评价感染情况。利用免疫荧光技术检测大鼠角膜TLR2表达以评价TLR2 siRNA转染的效率。利用实时定量PCR技术检测炎性细胞因子TNFa, IL-1β, IL-4, IL-6, IL12p40和趋化因子MCP-1和MIP-2表达水平。利用髓过氧化物酶(MPO)法检测多型核白细胞(PMN)浸润。 结果:TLR2 siRNA转染后,大鼠角膜TLR2表达明显减少,呈区域性、节段性分布。对照siRNA转染组角膜TLR2呈正常表达。对照组大鼠角膜给予烟曲霉菌接种后,角膜炎呈进行性发展,第1天可见角膜上皮呈毛玻璃样水肿,第3天可见明显的黄白色溃疡,边界不清,角膜缘充血明显;病变发展迅速,第4-5天为感染高峰期,溃疡面进一步扩大,表面凹凸不平,角膜中央区坏死组织脱落呈典型的龛状溃疡,可见后弹力层膨出、角膜葡萄肿甚至角膜穿孔。转染组感染后第1天角膜见轻度炎性浸润,第3天角膜浸润较前加重,但未见明显溃疡,第5天浸润开始减轻,面积逐渐局限、缩小,于2周左右完全愈合,仅存小片云翳及新生血管。对照组大鼠角膜炎性细胞因子TNFa, IL-1β, IL-4, IL-6, IL12p40及趋化因子MCP-1、MIP-2表达水平在第1天开始上调,于3-5天达到高峰,第7天开始下降并于2周后恢复至低水平。相比之下,TLR2 siRNA转染组炎性细胞因子TNFa, IL-1β, IL-6, IL12p40及趋化因子MCP-1、MIP-2水平明显降低,IL-4水平未见显著下调。TLR2 siRNA转染组PMN浸润较对照组明显减轻。 结论:siRNA可通过结膜下注射联合点眼的方式成功转入角膜组织。TLR2是角膜识别烟曲霉菌感染的主要受体,在诱导炎性细胞因子产生和炎性浸润发挥关键作用。TLR2siRNA可通过下调炎性细胞因子及炎性细胞浸润达到抑制角膜过度炎症反应和减少角膜损伤的目的,为探索利用TLR2基因沉寂治疗角膜真菌感染的新方法提供了理论依据。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 姜耀和;谷树严;郝继龙;王晓东;;细胞因子的相互作用对角膜基质细胞胶原代谢的影响[J];中国实验诊断学;2009年08期
2 李纳;;从基础教学开始突出维持和尽快恢复角膜上皮细胞完整的重要性[J];首都医科大学学报(社会科学版);2010年00期
3 蔡剑秋;施明光;韩真真;;角膜病相关细胞因子的研究进展[J];眼视光学杂志;2006年02期
4 ;基础疫苗学会议报告[J];中国生物制品学杂志;1989年01期
5 韦敏 ,张天宇;B_(16)-BL_6黑素瘤细胞因子基因转移的免疫生物学意义[J];国外医学.耳鼻咽喉科学分册;1995年01期
6 陈诗书;“瘤苗”——细胞因子转导人肿瘤细胞[J];生物工程进展;1999年04期
7 冯进波,许晓群,魏海明,刘文涛;脐血细胞因子基因表达的免疫学意义[J];临床输血与检验;2002年01期
8 宋仕玲,龚作炯;细胞因子及其网络对肝纤维化的作用[J];人民军医;2003年10期
9 余丹凤,沈盛晖,张庚,胡马洪,周颖;醒脑静注射液对重症颅脑损伤患者细胞因子及肺部感染的影响[J];中国中西医结合急救杂志;2005年05期
10 杨小进,毛勤生,周新泽;二硫代氨基甲酸吡咯烷预防腹腔粘连及其机制探讨[J];第二军医大学学报;2005年11期
11 杨晓静;闫元奎;路强;;翼状胬肉发病机制的研究进展[J];内蒙古医学院学报;2006年04期
12 张玥;侯玉芬;刘明;;炎性细胞因子在深静脉血栓形成中的作用[J];中国中西医结合外科杂志;2006年06期
13 施若非;李卫平;潘萌;罗邦国;李霞;郑捷;;伊曲康唑治疗特应性皮炎的疗效及机制[J];上海医学;2007年01期
14 周园;杜惠莲;王任群;;肺损伤中炎性细胞因子作用的研究进展[J];卫生职业教育;2007年12期
15 陆海华;史忠;刘波;周坤;李霞;尤再春;;急性胰腺炎相关性肺损伤患者早期血清TNF-α、IL-1、IL-6的变化及其临床意义[J];重庆医学;2007年18期
16 蔡伦;韩振龙;李金星;吕镇;;肺癌患者手术前后T_H1、T_H2细胞因子的变化[J];临床检验杂志;2007年05期
17 关秀茹;马学华;赵宇;蒋丽鑫;张萱;;肺炎衣原体感染与急性心肌梗死关系的研究[J];哈尔滨医科大学学报;2008年02期
18 杨大烜;杨静;李立环;;心脏瓣膜置换术患者围术期细胞因子浓度变化以及脑苷肌肽的影响[J];中国分子心脏病学杂志;2008年01期
19 徐红;毛一香;张学光;王庆才;;晚期消化道肿瘤患者化疗前后外周血血浆细胞因子的变化[J];肿瘤防治研究;2008年03期
20 杨鹏;;细胞因子在人体带绦虫感染中的研究现状及意义[J];黔南民族医专学报;2008年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 侯桂华;;猪皮片移植对HLA-DR4转基因小鼠细胞因子产生的影响[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
2 林俊杰;邱颖婕;冯明亮;马庆;范华骅;钱开诚;;多合一浓缩血小板在保存期中的活化情况的研究[A];第三届全国血液免疫学学术大会论文集[C];2003年
3 张玥;刘政;刘明;侯玉芬;王彬;;清热活血中药对深静脉血栓形成大鼠血清炎症细胞因子的影响研究[A];中华中医药学会周围血管病分会学术大会论文集(二)[C];2009年
4 庞勇;李雁;邹卓成;林军;何列涛;刘运珠;;益肾调督针法对脑梗塞恢复期细胞因子的影响[A];泛中医论坛·思考中医2006——经典中医的特色和优势论文集[C];2006年
5 张理涛;于广新;张玉环;卢桂玲;;牛磺酸对寻常性银屑病患者外周血单一核细胞产生细胞因子的影响[A];中华中医药学会皮肤科分会第四次学术年会;全国中医、中西医结合皮肤病诊疗新进展高级研修班论文集[C];2007年
6 张玉敏;石新钢;郭丽;段志文;马明月;裴秀丛;;DEHP对原代淋巴细胞Th1/Th2平衡的影响[A];中国环境诱变剂学会第14届学术交流会议论文集[C];2009年
7 吴稚冰;许亚萍;马胜林;吴伟;冯建国;姜初明;楼中平;;旋转磁场对大鼠放射性食管炎的防治[A];2009年浙江省放射肿瘤治疗学学术年会论文汇编[C];2009年
8 丁进;冯媛;朱平;;强直性脊柱炎患者单核/巨噬细胞分泌的细胞因子的研究[A];全国临床免疫检验研讨会暨第六届全国临床免疫学术会议论文汇编[C];2009年
9 张玉环;廉信;邢艳玲;刘艳华;;雷公藤多苷对变应性接触性皮炎患者细胞因子表达影响的研究[A];中华医学会2009年全国变态反应学术会议论文汇编[C];2009年
10 孙华;赵慧;张捷;包飞;魏镜;王道海;张云祥;;电针百会、足三里对抑郁症患者血清中炎性细胞因子水平的影响[A];中国针灸学会2009学术年会论文集(下集)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭慧;Toll样受体介导角膜真菌感染炎症反应的作用及基因沉寂治疗研究[D];山东大学;2010年
2 宋春辉;模拟HCV HVR1免疫7肽对人不同免疫细胞分泌细胞因子影响的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
3 刘占国;应用全血细胞因子谱评估肾移植受者免疫状态[D];南方医科大学;2010年
4 吕琼霞;运输应激对猪免疫机能的影响及其调控机理初探[D];南京农业大学;2009年
5 姜春来;细胞因子对HIV-1疫苗DNA prime/MVA boost的加强作用[D];吉林大学;2005年
6 张晓红;T-依赖性B淋巴细胞激活机制的探讨[D];中国协和医科大学;1993年
7 岳欣;CIK细胞治疗恶性实体瘤的临床前研究[D];天津医科大学;2005年
8 汪宇春;细胞因子基因多态性与移植物抗宿主病关系的研究[D];四川大学;2005年
9 张新颖;乌司他丁对内毒素性急性肺损伤大鼠的保护作用及机制的实验研究[D];山东大学;2011年
10 羊继平;肾移植供受者细胞因子及细胞因子受体基因多态性对近期移植效果的影响[D];第二军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘珠果;猪卵母细胞孤雌激活、胚胎培养和成熟过程中细胞因子作用的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
2 邢爱红;胰炎灵颗粒剂对重症急性胰腺炎大鼠体内炎性介质影响观察[D];山东中医药大学;2003年
3 王延春;扶正平消汤联合化疗对恶性肿瘤病人免疫功能影响的研究[D];山东中医药大学;2005年
4 曹广生;中药复方消瘤平的抗肿瘤作用研究[D];山东大学;2005年
5 赵雷;人高迁移率族蛋白1的克隆、表达及其功能研究[D];第一军医大学;2005年
6 卫荣;维医沙疗对实验性兔膝骨关节炎的作用机制[D];新疆医科大学;2005年
7 唐玉红;小鼠白介素12质粒对哮喘模型CD4~+CD25~+T细胞及其相关细胞因子的影响[D];浙江大学;2006年
8 郭广宏;应用生物芯片技术对不同人群血清细胞因子临床意义的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
9 万钧;中药(强脊1号)对活动期强直性脊柱炎作用的临床研究[D];中国中医科学院;2006年
10 孙岩;补髓生血颗粒加维甲酸对骨髓增生异常综合征—难治性贫血患者c-met mRNA影响的研究[D];黑龙江中医药大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 吴一福;细胞因子与病理性瘢痕形成密切相关[N];中国医药报;2005年
2 赵喜明;儿童癫痫病因新解[N];中国医药报;2004年
3 杨慎峭 刘旭光 余曙光;艾灸治疗关节炎机制与细胞因子有关[N];中国医药报;2005年
4 许沈华;肿瘤基因疫苗已见端倪[N];家庭医生报;2007年
5 新言;中医证的本质是细胞因子吗?[N];科技日报;2005年
6 陈金伟;精浆中多种因子在CP的发病中起重要作用[N];中国医药报;2006年
7 科文;中科大肝脏天然免疫研究获新成果[N];中国医药报;2006年
8 正;干扰素/白介素可减弱细胞因子的抗抑郁作用[N];中国高新技术产业导报;2001年
9 曹阳;痰热清注射液有效抑制多器官功能障碍综合征患者细胞因子[N];健康报;2007年
10 肖鑫;抑制骨肿瘤细胞因子找到[N];健康报;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978