IL-18/IL-18BP在ITP发病机制中的调控及其免疫干预作用探讨

【摘要】： 免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenia, ITP),亦称特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),是一种自身免疫性出血性疾病,该病的特点是患者体内抗血小板抗体增多,血小板破坏过多而出血。其发病机制目前尚未完全明了,但确认与免疫应答异常有关。近年来,国内外学者在ITP方面进行了大量的基础和临床研究,虽取得阶段性成果,但其发病机制、早期诊断和治疗措施仍处于探索之中。深入研究ITP发病免疫异常机制,探讨阻断ITP发病途径无疑对于ITP的诊治具有重要意义。 大量实验研究表明,ITP的发病与细胞免疫功能异常关系密切。尽管B细胞过度增殖、活化和成熟产生多种针对血小板的自身抗体(包括抗血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/Ⅲa、GP Ib抗体)是ITP发病的直接原因,但T细胞亚群功能和比例失调导致B细胞激活可能才是ITP主要的发病机制,部分情况下,细胞毒性T细胞可直接导致ITP患者的血小板溶解。许多研究表明在ITP中,T辅助细胞(Th)1和Th2处于失衡状态,Th1／Th2比例明显上调。 Th可以分化为Th1、Th2和Th17亚群。目前研究资料表明,Th1／Th2细胞的平衡,是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽,在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用。Th1细胞主要分泌IL-2,IFN-γ,TNF-α等细胞因子,介导迟发型超敏反应(DTH)和巨噬细胞活化等细胞免疫反应；Th2细胞主要分泌IL-4,IL-5,IL-10和IL-13等细胞因子,促进B细胞增殖并分化成浆细胞,分泌特异性抗体,提高黏膜免疫力,介导体液免疫和Ⅰ型超敏反应。近年来,研究发现CD8+T至少也可分为两群,一群与Th1细胞相似,分泌IL-2,IFN-γ,TNF-α等细胞因子,称为Tc1；另一群与Th2细胞相似分泌IL-4,IL-5,IL-10等细胞因子,称为Tc2。人们将Th1和Tc1,Th2和Tc2分别统称为Th1类、Th2类细胞。Th细胞之间的失衡与许多疾病的发生、发展密切相关,多数活动性器官自身免疫病倾向于Th1细胞反应,而Th2细胞反应往往与自身免疫病保护有关。本研究证实ITP患者存在Th1极化现象,与Panitsas FP等人研究相符。 作为T细胞炎症介质的强有力的诱导者,IL-18通过刺激Th1反应、诱导严重免疫紊乱,从而参与一些免疫疾病的发生发展。IL-18是1996年正式命名的细胞因子,主要由单核巨噬细胞产生,是一种强有力的免疫调节因子,其结构与IL-1相似,功能与IL-12相似,但发挥作用却不依赖于两者。人在正常状态下,产生于细胞内的IL-18是以没有生物活性的前体形式存在,由193个氨基酸组成,无N糖基化位点和疏水信号肽序列,N-端有一36个氨基酸的前导序列。经IL-1β转化酶(IL-1βconverting enzyme, ICE)切除其前导序列后,IL-18才以单体的形式表现出生物学活性。与IL-18受体(interleukin 18 receptor, IL-18R)结合,通过IL-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)途径活化肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6, TRAF-6)诱导NF-κB结合DNA信息,促进INF-γ等Th1细胞相关因子的释放而导致Th1／Th2失衡的发生。IL-18还可增强Th1细胞的FasL表达,增强FasL介导细胞毒效应,促使T、B细胞的凋亡发生,而凋亡细胞数量与自身免疫疾病活动性相关,因而IL-18在免疫系统和疾病的自我调节过程中发挥重要作用。IL-18结合蛋白(interleukin 18 binding protein, IL-18BP)为Novick等新近发现的一种糖蛋白,属于免疫超家族成员,能抑制IL-18诱导Th1细胞产生INF-γ,降低INF-γ对NF-κB的激活作用,是IL-18的天然拮抗剂,与IL-18协调作用参与细胞免疫反应。大量研究证实IL-18和IL-18BP在自身免疫性疾病的发生、发展中发挥重要的作用：在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)等自身免疫性疾病的患者和动物模型中已经检测出上述因子mRNA和蛋白质的表达失衡,而通过内外源性IL-18BP抑制IL-18的作用已成为抗自身免疫性疾病的重要着眼点。但是,IL-18体系在ITP的疾病进程中的作用还没有得到清楚的了解。 近年来,T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing molecules, Tim-3)在自身免疫性疾病中的作用日益受到人们的重视。Tim-3又称HAVcr-2(hepatitis A vires cell receptor 2),只选择性表达在分化的Th1细胞而不是Th2细胞上,通过与Tim-3配体(Tim-3 ligant, Tim-3L)即半乳糖凝集素-9(Galectin-9, Gal-9)结合,给T细胞提供一种负性共刺激信号,下调Th1及Th17细胞的反应,在自身和异体免疫性疾病以及免疫耐受中起着重要作用。既然ITP是一种Th1极化模式的自身免疫性疾病,而Tim-3特异性的表达于Th1细胞中,那么Tim-3是否在ITP发病中发挥作用呢? 本研究以IL-18,IL-18BP,Tim-3等细胞因子的mRNA和蛋白质表达为指标,从细胞和分子水平探讨IL-18体系及Tim-3在ITP的发生和发展的作用。 第一部分IL-18／IL-18BP在ITP发病及地塞米松治疗中的意义研究 目的： 探讨ITP患者体内IL-18,IL-18BP,IFN-γ,IL-4；转录因子T-bet,GATA-3的表达及地塞米松的作用,分析IL-18／IL-18BP在ITP患者中Th1类细胞优势应答中的作用。 方法： (1)抽取37例ITP急性期患者,21例ITP缓解期患者和24例正常人的外周血15mL,其中17例初诊患者标本分别在大剂量地塞米松治疗前和治疗后两周采样。 (2)从外周血中分离单个核细胞,提取mRNA。 (3)应用ELISA检测ITP急性期,缓解期患者和正常对照外周血IL-18,IL-18BP.IFN-γ和IL-4的含量。 (4)应用RT-PCR检测ITP急性期,缓解期患者和正常对照IL-18,IL-18BP,IFN-γ,IL-4和T-bet,GATA-3的表达。 结果： (1)经ELISA检测,37例ITP急性期患者血浆中IL-18及IFN-γ的含量明显高于对照组和缓解期患者；IL-4的含量明显低于对照组；而IL-18BP的含量没有明显变化,IL-18／IL-18BP升高。 (2)经RT-PCR检测,ITP急性期患者外周血单个核细胞的IL-18,IFN-γ和T-bet的表达明显升高；IL-4和GATA-3的表达明显降低,IL-18BP的含量没有明显变化。 (3)大剂量地塞米松治疗后,IL-18,IFN-γ和T-bet含量明显降低,IL-18BP含量明显升高。 结论： (1)证实了IL-18,IL-18BP参与了ITP发病； (2)大剂量地塞米松能够促进IL-18BP的生成,拮抗IL-18的作用而缓解ITP的发病； (3)应用外源性IL-18BP干预IL-18的作用可能成为ITP治疗的一个新靶点。 第二部分IL-18BP对ITP患者外周血单个核细胞免疫干预机制探讨 目的： 研究外源性IL-18BP对ITP外周血单个核细胞(PBMCs)中IFN-γ,IL-4,IL-10等细胞因子的表达及细胞凋亡的影响,初步探讨IL-18BP在ITP免疫治疗中的作用和意义。 方法： (1)收集我院2007年12月—2008年12月10例初诊ITP急性期患者及10例正常对照； (2)从外周血中分离单个核细胞,取不同浓度的IL-18BP与PBMCs细胞共同培养48h； (3)采用ELISA和RT-PCR的方法检测IFN-γ,IL-4,IL-10,IL-2及TNF-α蛋白和mRNA的表达； (4)CCK-8法检测IL-18BP作用后淋巴细胞的增殖情况； (5)AnnexinV-FITC/PI流式细胞技术检测IL-18BP作用后淋巴细胞凋亡的情况。 结果： (1)IL-18BP明显抑制ITP患者和正常对照组PBMCs中IFN-γ蛋白和mRNA的表达(P0.01),与对照组相比,ITP组抑制更为明显(P0.01)；同时IL-18BP能促进ITP患者和正常对照组PBMCs中IL-10的表达； (2)IL-18BP对ITP患者和正常对照组的淋巴细胞增殖没有影响(P0.05)； (3)AnnexinV-FITC-FCM分析见,ITP急性期PBMCs加入IL-18BP后凋亡细胞增加,而正常对照组无差异(P0.05)。 结论： IL-18／IL-18BP在ITP的免疫紊乱和发生发展中起着一定的作用,外源性IL-18BP能够抑制ITP患者体外PBMCs中IFN-γ的表达,促进IL-10的生成；还可通过调节淋巴细胞凋亡对ITP免疫失调起调节作用。也提示我们通过增加IL-18BP含量拮抗IL-18产生和活性可能是ITP治疗的一个策略和方向。 第三部分IL-18／IL-18BP及Tim-3在ITP患者脾脏的表达 目的： 探讨ITP患者脾脏IL-18,IL-18BP,IFN-γ,IL-4,Tim-3及转录因子T-bet,GATA-3的表达,分析IL-18,IL-18BP,Tim-3在ITP患者中Th1类细胞优势应答中的作用。 方法： (1)收集我院2007年12月—2008年12月ITP患者行外科手术治疗脾切除标本12例；同时另选2001年1月—2008年12月因创伤性脾破裂而手术切除的正常脾标本10例作对照研究； (2)采用免疫组化检测ITP及对照组脾脏IL-18,IL-18BP,Tim-3的表达； (3)采用免疫荧光检测ITP及对照组脾脏IL-18,IL-18BP,Tim-3的表达; (4)从脾中分离单个核细胞,置于含PHA 10μg／mL,10%FCS的RPMI1640完全培养基中；在37℃,5%CO2培养箱中培养48小时后收集细胞悬液及PBMCs备用； (5)采用ELISA的方法检测IFN-γ,IL-4,IL-18及IL-18BP蛋白的表达; (6)采用RT-PCR的方法检测IFN-γ,IL-4,IL-18及IL-18BP及转录因子T-bet,GATA-3的表达。 结果： (1)免疫组化及免疫荧光结果显示：IL-18及IL-18BP在ITP患者脾脏中的表达明显高于正常对照组；而Tim-3在ITP患者脾脏中的表达和阳性率均低于正常对照组： (2)脾PBMCs培养48小时后,ITP患者IL-18和IFN-γ的含量较正常对照明显升高；IL-18BP含量两组间无统计学意义(P=0.646)；IL-4低于检测限； (3)RT-PCR检测脾PBMCs中细胞因子mRNA结果显示ITP患者IL-18的表达是正常对照的3倍,IL-18BP的含量较正常对照明显升高。Th1细胞因子IFN-γ及转录T-bet表达升高,而Th2细胞因子IL-4和转录因子GATA-3的含量较正常对照明显下降,比较具有统计学意义(P0.05)。脾PBMCs在PHA的刺激下培养48h后ITP患者IL-18和IFN-γ的表达较正常对照明显升高。 结论： (1)ITP患者脾脏中存在Th1／Th2细胞因子极化； (2)ITP患者脾脏中Tim-3-Gal-9通路失衡,可能参与ITP的发病； (3)ITP患者脾脏CD4+T细胞分化紊乱,分泌Thl细胞因子(IL-18,IFN-γ)能力异常升高。