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不同类型的DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究

刘春梅  
【摘要】: 目的 调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是具有免疫负调控作用的T亚群,它在维持外周免疫耐受,控制自身免疫性疾病、过敏反应和诱导移植耐受等方面发挥重要的保护作用,成为近几年来免疫学的研究热点之一。目前,在调节性T细胞的研究中,对CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)的特性研究得较多。已知CD4+CD25+Treg主要有两大类:一类是天然CD4+CD25+调节性T细胞(natural occurring regulatory T cell, nTreg),在胸腺中产生,存在于正常机体内,在小鼠脾脏和人外周血中占CD4+T细胞的5-10%;另一种是诱导性CD4+CD25+调节性T细胞(inducible regulatory T cell, iTreg),在外周合适的条件(如TCR刺激和细胞因子TGF-β或IL-10)下可以由CD4+CD25-T细胞转化而来。iTreg与nTreg具有相同的表面标记和抑制功能,主要标记有CTLA-4、GITR和Foxp3,其中转录因子Foxp3是目前广为应用的Treg最重要的特异性标志,不仅是后者分化发育的标志,更是其功能性标志。近年来,利用Treg的免疫抑制效应控制机体过度或不适的免疫应答进而防治疾病成为免疫治疗的新策略。然而,有限的Treg数量限制了Treg的临床应用,因此寻找扩增或诱导CD4+CD25+Treg的有效方法,并深入探索其机制,成为推动Treg临床应用的前提和基础。 树突状细胞(dendritic cells, DCs)是机体重要的抗原递呈细胞。已有的研究显示DCs不仅在效应性T细胞的活化和增殖方面发挥重要作用,而且具有扩增和诱导Treg产生的作用。负载抗原的DCs在外源性IL-2存在的情况下可以扩增nTreg;在细胞因子如TGF-β、IL-10或Vitamin D等存在的情况下,DCs可以将CD4+CD25-T细胞诱导转化为Foxp3+Treg。然而,在这些诱导和扩增的实验方法中,CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞都需要从CD4+T细胞群体中分离纯化出来,然后在体外加入不同的外源性细胞因子进行诱导或扩增,使得整个实验过程变得复杂化而且成本也相对较高。既然CD4+T细胞群体不仅含有CD4+CD25+的nTreg,也含有CD4+CD25-的iTreg前体细胞,那么我们是否可以不加外源性细胞因子,不需分离纯化而利用DCs直接刺激CD4+T细胞群体产生Treg?故本研究的目的一是探索DCs是否可直接从CD4+群体中产生Treg,哪种类型DCs(同种同型与同种异型、未成熟与成熟)作用最强,机制如何?进而建立简便、价廉的产生Treg的方法,推动Treg的临床应用。 DCs在体内分化、成熟和发挥作用时常常处于不同的微环境,氧压是微环境中的重要因素。生理或病理情况下组织细胞经常处于不同氧压的微环境,如在动脉栓塞、器官移植过程中,早期局部组织是处于一种远远低于大气氧压的低氧或乏氧状态。当外界因素撤除或手术致使原本处于低氧状态的组织血流通畅,氧供随之恢复,即发生再氧合。这种乏氧-再氧合的病理生理过程,经常见于缺血再灌注损伤。那么不同氧压对DCs的分化成熟及功能有何影响?不同氧压微环境中产生的DCs对T细胞分化特别是对Treg分化有何影响?目前都尚不清楚。我们在前期研究中发现乏氧可抑制DCs的表型成熟和对T细胞的刺激功能。故本课题的目的二是在前期研究的基础上,进一步研究乏氧-再氧合条件下小鼠DCs表型及功能变化,分析再氧合DCs对Th细胞及调节性T细胞的分化影响,并对其内在分子机制进行探讨。这为解释缺血再灌注损伤的发病机制,控制器官移植的排斥反应以及肿瘤免疫治疗奠定一定的基础。 总之,本课题包括两部分内容:一、同种异型DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究;二、再氧合DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究。 第一部分同种异型DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究 方法 一、小鼠骨髓来源DCs的诱导 1.分离C57BL/6或BALB/c小鼠的骨髓细胞,利用细胞因子GM-CSF和IL-4诱导BM-DCs。 2.隔2天半量换液,第6天时给予LPS(1μg/ml)刺激24h,以诱导成熟。 二、自体DCs或同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的能力 1.用免疫磁珠分离纯化BALB/c小鼠脾脏CD4+T细胞,分别与自体(同基因型)DCs或同种异型DCs共培养。 2.流式细胞术(FCM)检测培养体系中CD4+CD25+Treg的比例。 三、人外周血单个核细胞来源的DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的能力 1.获取不同人外周血10-15m1,分离单个核细胞(PBMC)。 2.免疫磁珠法分离CD4+T细胞。 3.PBMC静置2h后去除未贴壁细胞,给予重组人GM-CSF和IL-4诱导成DCs。 4.将不同人的CD4+T细胞与DCs做同种异型或自体的细胞共培养。 5.流式细胞术(FCM)检测培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。 四、增殖抑制试验检测CD4+CD25+Treg的抑制功能 1.将第一步中同种异型混合淋巴细胞培养产生的Treg (generated Treg)纯化后作为抑制细胞,同种异型DCs作为刺激细胞,标记了CFSE的CD4+CD25-T细胞作为反应细胞,反应细胞:抑制细胞按照不同比例共培养。 2.新鲜分离的天然Treg作为实验阳性对照,流式检测反应细胞的增殖情况。 五、细胞因子在CD4+CD25+Treg产生中的作用 (一)探索IL-2在同种异型DCs刺激Treg产生中的作用 1.分离小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞,标记CFSE,与同种异型DCs共培养,并给予IL-2刺激,5天后FCM检测同种异型DCs对CD4+CD25+T细胞的增殖情况。 2.分离CD4+CD25+T细胞,标记CFSE,然后与CD4+CD25-T细胞按照原来比例混合成CD4+T细胞整体,与同种异型DCs共培养,培养5天后收集上清,ELISA检测IL-2的水平。 3.IL-2阻断试验:上述体系中加入抗IL-2的中和性抗体,对照组加入同型对照IgG,5天后流式检测CD4+CD25+T细胞的增殖情况。 (二)探索TGF-p在同种异型DCs刺激Treg产生中的作用 1.分离小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞,标记CFSE,与同种异型DCs共培养,不同时间后流式检测Foxp3的表达和CFSE的情况。 2.收集不同时间的上清,ELISA检测TGF-p水平。 3.TGF-p阻断试验:上述体系中加入不同浓度的TGF-p受体Ⅰ激酶抑制剂Ⅱ(ALK-5抑制剂Ⅱ),培养5天后检测Foxp3的表达。 结果 一、在无外源性细胞因子存在的情况下,小鼠同种异型DCs可刺激CD4+T细胞高效产生Treg,但自体DCs无此作用 新鲜纯化的CD4+T细胞纯度大于95%,其中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例小于10%。自体BM-DCs与抗CD3抗体联合刺激CD4+T细胞3-5天后,T细胞大量活化,CD4+CD25+T细胞的比例明显增加(90%),但其中Foxp3+T细胞的比例仍然小于10%。然而,用同种异型BM-DCs刺激CD4+T细胞后,尽管活化的CD4+CD25+T细胞的比例较自体DCs刺激体系低(50%-70%),然而其中Foxp3+T细胞的比例高达80%以上。随着培养时间的延长,体系中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例增加5-7倍。值得注意的是,未成熟同种异型DCs和成熟同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的能力无明显差异。 二、人同种异型DCs在没有外源性细胞因子的情况下,同样可以增加CD4+T细胞中Treg的比例 为了进一步证明同种异型DCs刺激Treg产生的能力,我们从人PBMC中用重组人GM-CSF和IL-4分别诱导同种异型或自体DCs,与CD4+T细胞共培养,流式检测体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。结果显示,自体DCs活化的CD4+CD25+T细胞中Foxp3+细胞表达在10%左右,而同种异型DCs活化的CD4+CD25+T细胞中Foxp3+Treg的比例高达40%左右,其作用与小鼠的同种异型DCs相似。 三、同种异型DCs产生的Treg在体外具有抑制功能 为了进一步证明同种异型DCs刺激产生的Treg (generated Treg)在体外是否保持其特有的抑制功能,我们将小鼠同种异型DCs刺激产生的CD4+CD25+T细胞纯化后作为抑制细胞,按照不同比例与反应细胞CD4+CD25-T细胞共培养,一定时间后流式检测反应细胞的增殖情况,结果发现,同种异型DCs刺激产生的Treg在体外具有明显的抑制功能,与新鲜分离的nTreg一致。 四、内源性IL-2和TGF-β在同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg中发挥重要作用 为了探讨同种异型DCs刺激CD4+T细胞高效产生Treg的机制,我们进一步研究了内源性IL-2和TGF-β在同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg中的作用。 1.IL-2在同种异型DCs刺激Treg扩增中发挥重要作用 1)用CFSE标记和流式细胞术证明在外源性IL-2存在的情况下,DCs可以有效的扩增nTreg 分离纯化CD4+CD25+T细胞后用CFSE标记,然后与同种异型BM-DCs共培养,并给予外源性IL-2刺激,5天后流式检测细胞增殖情况,发现同种异型DCs可以有效扩增CD4+T细胞中的nTreg。 2)用抗体阻断的方法证明内源性的IL-2在同种异型DCs刺激Treg扩增中发挥重要作用 分离纯化CD4+CD25+T细胞后用CFSE标记,然后与CD4+CD25-T细胞按照原有的比例混合,与同种异型BM-DCs共培养,ELISA检测上清中细胞因子IL-2的水平,发现同种异型DCs刺激组中IL-2的水平明显高于对照组。为了进一步验证体系中IL-2的作用,在如上体系中同时加入抗IL-2的中和抗体,5天后收集细胞,流式检测细胞CFSE增殖情况,发现与对照组IgG相比,IL-2阻断抗体可以明显抑制CD4+T细胞群体中CD4+CD25+T细胞的增殖。这说明同种异型DCs对CD4+CD25+Treg的有效扩增依赖于体系中的内源性IL-2。 2.TGF-β在同种异型DCs诱导Treg产生中发挥重要作用 1)用CFSE标记和流式术证明同种异型DCs可以诱导Treg的产生 新鲜分离小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞,用CFSE标记,然后与同种异型BM-DCs共培养不同时间后,收集细胞,流式检测Foxp3的表达情况。结果显示,第5天时,同种异型DCs刺激的CD4+CD25-T细胞与新鲜分离的CD4+CD25-T细胞相比,Foxp3+T细胞比例明显增加。随着培养时间的延长,Foxp3+T细胞比例逐渐增加。当培养到第13天时,Foxp3的表达达到第5天时的两倍。这表明在没有外源性TGF-p存在的情况下,同种异型DCs可以诱导CD4+CD25-T向CD4+CD25+Foxp3+T细胞转化。 2)同种异型DCs刺激体系中存在内源性TGF-β的产生 收集培养不同时间的上清,ELISA检测上清中TGF-p的水平,结果提示,培养到第5天时,总的TGF-p水平明显增加。并随着培养时间的延长,其水平逐渐升高。当培养第13天时,TGF-β水平达到第5天时的2-3倍。 3)用抑制剂阻断的方法证明内源性TGF-β在同种异型DCs刺激Treg产生中发挥重要作用 为进一步验证产生的TGF-p在CD4+CD25+Foxp3+T细胞诱导中的作用,我们在如上体系中加入不同浓度的TGF-p受体Ⅰ激酶抑制剂Ⅱ(ALK-5抑制剂Ⅱ),定时间后,流式检测Foxp3的表达。结果显示,体系中CD4+Foxp3high T细胞的百分比和绝对数随着ALK-5抑制剂Ⅱ浓度的增加而逐渐降低,且CD4+Foxp3dim T细胞的百分比和绝对数显著下降,与加入的ALK-5抑制剂Ⅱ浓度具有明显的剂量依赖关系。所以我们推测CD4+Foxp3dim T细胞可能是转化的Foxp3+T细胞的潜在群体,且TGF-p在转化过程中发挥着重要的作用。 结论 1.小鼠同种异型BM-DCs和人PBMC诱导的同种异型DCs,在无外源性细胞因子的情况下,都可以增加CD4+T细胞中Treg的比例,产生的Treg在体外对T细胞增殖具有抑制功能。 2.同种异型BM-DCs刺激的体系中,内源性IL-2和TGF-p在Treg的产生中发挥着重要的作用。 创新性和意义 1.首次发现同种异型BM-DCs在没有外源性细胞因子的情况下可以刺激CD4+T细胞高效产生Treg,并探讨了其机制。 2.首次将CD4+T细胞作为一个整体来寻找获得足够数量Treg的方法,为优化后续研究的实验方法、制定Treg的临床治疗策略提供了一定的理论依据。 研究的局限性 1.同种异型BM-DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的具体内在分子调控机制有待于进一步深入研究。 2.所获得Treg应用于临床,其条件仍需进一步优化。 第二部分再氧合DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究 方法 一、再氧合对DCs的表型影响 1.分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,分别在常、乏氧条件下利用GM-CSF和IL-4诱导DCs,并给予LPS刺激。 2.对乏氧条件下分化的DCs进行再氧合不同时间。 3.流式检测再氧合DCs表面协同刺激分子及MHC-Ⅱ类分子的表达。 二、再氧合对DCs的Th细胞增殖、分化的影响 1.分离CD4+T细胞并标记CFSE,与再氧合的同种异型DCs或自体DCs共培养,后者给予抗CD3抗体刺激。 2.流式检测再氧合DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力。 3.收集细胞,流式检测再氧合DCs刺激CD4+T细胞的分化情况。 三、再氧合影响DCs表型及功能的分子机制研究 1.将乏氧下分化的DCs进行再氧合,Real time PCR的方法检测其表达四种腺苷受体的mRNA水平。 2.以不同腺苷受体激动剂处理再氧合的DCs,流式检测其表型的变化。 3.流式检测不同浓度A2AR腺苷受体激动剂对再氧合的DCs表型的影响。 4.ELISA检测A2AR激动剂对再氧合DCs的细胞因子表达的影响。 结果 一、再氧合可逆转乏氧对DCs成熟表型的抑制 为了研究再氧合对DCs表型的影响,我们在乏氧条件下诱导DCs后对其进行再氧合不同时间,流式检测细胞表面分子的表达。结果显示乏氧抑制DCs协同刺激分子CD80、CD86以及MHC-Ⅱ类分子的表达。再氧合6小时后其表达百分比和荧光强度均明显上调,且荧光强度随再氧合时间的延长而逐渐增加,再氧合24h、48h可达到高峰。这提示再氧合可以逆转乏氧对DCs表型的抑制,促进DCs向成熟方向分化。 二、再氧合DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力较乏氧DCs明显增强 无论是在同种异型混合淋巴细胞反应体系中,还是在CD3单抗刺激的体系中,乏氧DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力与常氧DCs相比非常弱。再氧合后,其诱导CD4+T细胞增殖的能力明显提高。这提示无论针对同种异型抗原,还是自体抗原,再氧合DCs均具有很强的抗原递呈功能。 三、再氧合DCs降低Treg的数量而上调Th17和Thl细胞应答 进一步我们检测了同种异型混合淋巴细胞反应体系中,再氧合的DCs对CD4+T细胞分化的影响。结果显示,再氧合DCs诱导产生的CD4+CD25+Foxp3+Tregs,与常氧成熟和未成熟DCs相比,明显减少;相反,再氧合DCs可显著诱导CD4+T细胞向IL-17+Th17细胞分化,其比例明显高于未成熟DCs,甚至常氧成熟DCs刺激产生的IL-17+Th17细胞。同时,IFN-γ+Th1细胞的比例和上清中IFN-γ的水平也明显高于常氧成熟和未成熟DCs刺激组。我们进一步研究了再氧合DCs的细胞因子分泌情况。结果证实再氧合24h的DCs上清中IL-6水平显著升高,而TGF-p的水平则与乏氧组相比明显降低。这提示再氧合DCs分泌的细胞因子更有利于使CD4+T细胞向Th17方向分化。总之,这些结果表明再氧合DCs具有很强的驱动Th17和Thl细胞介导的炎性反应的能力。 四、腺苷-A2AR通路在DCs乏氧-再氧合过程中发挥着重要的作用 1.再氧合可上调腺苷受体A2AR在DCs的表达,而对A1R、A2BR及A3R的表达无明显影响 为了研究腺苷通路是否参与乏氧-再氧合对DCs表型和功能的影响,我们首先采用Real time PCR方法检测了再氧合DCs的四种腺苷受体的mRNA表达水平,结果显示,与常氧及乏氧DCs相比,再氧合DCs表达的A2AR水平呈现明显升高趋势;而各组之间A1R、A2BR及A3R的表达则无明显变化。 2.A2AR受体激动剂可抑制再氧合DCs成熟相关表型的上调 为了进一步确认腺苷通路在乏氧-再氧合对DCs表型和功能的影响,我们在将乏氧下分化的DCs进行再氧合时,给予不同腺苷受体激动剂刺激,流式检测DCs的表型。筛选结果提示,与对照组(再氧合组)相比,A2AR受体选择性激动剂CGS21680可以抑制再氧合对乏氧DCs表型的上调作用,即抑制MHC-Ⅱ和协同刺激CD80、CD86的表达。而A1R、A2BR、A3R的激动剂则没有此功能。 3.A2AR激动剂对再氧合DCs表型的抑制具有浓度依赖性 体外进一步检测了不同浓度的A2AR受体选择性激动剂CGS21680对再氧合DCs表型的影响。流式结果显示,随着CGS21680浓度的增加,协同刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ表达的平均荧光强度逐渐降低,与对照组相比有显著性差异,这进一步提示A2AR通路确实在DCs的乏氧-再氧合过程中发挥着重要的作用。 4.A2AR激动剂可明显抑制再氧合DCs促炎细胞因子产生,而上调抑炎细胞因子产生 我们进一步检测了不同腺苷受体激动剂对再氧合DCs的细胞因子分泌情况,ELISA结果显示A2AR选择性激动剂CGS21680可以明显抑制再氧合DCs炎性细胞因子IL-1p、IL-6和TNF-a等的分泌,而上调其免疫抑制因子TGF-p的分泌。这说明腺苷受体通路参与再氧合逆转乏氧对DCs功能的影响,A2AR受体通路可能是再氧合上调DCs表型和功能的一个重要调节分子。 结论 一、再氧合可以逆转乏氧对DCs成熟表型及功能的抑制作用 1.再氧合可明显促进乏氧下分化DCs的表型成熟。 2.再氧合可明显促进DCs对同种异型及同种同型抗原的递呈功能,明显增强DCs对CD4+T细胞增殖的能力,可降低Treg的数量而促进CD4+T细胞向Th17和Th1方向分化。 二、腺苷受体通路参与再氧合逆转乏氧对DCs表型及功能的影响 1.再氧合DCs表达高水平腺苷受体A2AR。 2.A2AR激动剂CGS21680抑制再氧合逆转乏氧对DCs表型的能力,并具有浓度依赖性。 3.A2AR激动剂CGS21680抑制再氧合DCs炎性细胞因子的表达。 创新性和意义 1.首次发现再氧合可明显逆转乏氧对DCs的成熟表型及功能的影响,这为解释缺血再灌注损伤的发病机制提供有力的证据,证明乏氧-再氧合可能是导致缺血再灌注损伤的内在机制之一。 2.首次发现A2AR腺苷受体通路抑制再氧合对乏氧DCs表型及功能的逆转作用,为寻找从免疫学角度治疗缺血再灌注损伤的新策略提供新思路。 研究的局限性 1.腺苷通路参与再氧合促进乏氧DCs表型及功能成熟的内在分子机制仍需进一步研究。 2.腺苷受体激动剂应用于治疗IRI的体内实验有待于进一步补充。


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