TLR4在1型糖尿病肾病及TLR3在自身免疫性肝炎中作用的研究

【摘要】： 背景 糖尿病肾病是年轻人终末期肾病的主要原因,40%的长期1型糖尿病患者最后会进展成糖尿病肾病。当前的治疗,包括降糖、降压、改善高脂血症都会延缓糖尿病肾病的进展,但最终还是会有一部分糖尿病患者最后发展为慢性肾衰竭。因此,最大限度地发挥当前治疗的效应,以及确立新的治疗策略和找出其他的治疗靶点在糖尿病肾病治疗中显得尤为重要。 很多因素参与了糖尿病肾病的进展。代谢性因素,例如糖基化终末产物的形成和多羟基产物的增加都参与了糖尿病肾病。很多生长因子也在糖尿病肾病中起到了一定作用。虽然糖尿病肾病不是主要由免疫反应介导,然而在1型糖尿病病人肾脏活检中发现了球旁器中T淋巴细胞的浸润。此外,在1型和2型糖尿病肾病患者肾活检切片中都发现了巨噬细胞的浸润。基于这些发现,探讨免疫系统在糖尿病肾病中的作用就尤为重要。 TLR在天然性免疫和获得性免疫系统中都发挥了非常重要的作用。TLR4主要表达在巨噬细胞等免疫细胞表面,同时也表达在气道上皮、脂肪组织、骨骼肌、血管内皮细胞和平滑肌细胞等组织细胞,是革兰氏阴性细菌脂多糖的主要受体。同时TLR4也可以结合包括热休克蛋白、纤维粘素、纤维原、游离脂肪酸、饱和脂肪酸在内的内源性配体。TLR4激活后可以产生炎性细胞因子。近年的研究表明1型糖尿病患者外周血单核细胞表面上的TLR2和TLR4表达增加。TLR4在1型糖尿病的发病、肥胖和2型糖尿病的胰岛素抵抗中都起到重要作用。 研究目的 1.在这项研究中,利用非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠,建立1型糖尿病模型和糖尿病肾病模型。 2.利用这个模型,探讨NOD小鼠糖尿病肾病免疫病理的改变。 3.探讨细胞免疫反应和体液免疫反应在糖尿病肾病不同发病病程中的作用。 4.利用TLR4基因敲除(TLR4-/-NOD)小鼠,探讨TLR4在1型糖尿病早期肾病中的作用。 材料与方法 1.动物：雌性NOD/Caj小鼠以及TLR4-/-NOD小鼠 2.糖尿病模型和糖尿病肾病模型的建立：通过筛查尿糖以及测定血糖水平来明确糖尿病,通过筛查尿蛋白以及24小时尿蛋白定量来确定糖尿病肾病。 3.组织学染色：灌注肾脏,4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片后进行过碘酸-雪夫(PAS)染色确定肾小球细胞外基质的沉积。 4.免疫荧光染色和共聚焦显微镜检查：肾脏灌注后放入高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液中(PLP)固定,速冻切片后,加入一抗和二抗进行染色,共聚焦显微镜观察。 5.电子显微镜检查：投射电镜观察肾小球形态,免疫金颗粒标记进一步证实免疫球蛋白的沉积和沉积位置。 6.RNA提取和实时定量PCR技术：TRIzol从小鼠肾脏组织中分离出总的RNA,反转录合成cDNA,进行引物设计后,实时定量PCR测定相关基因的表达。 7.抗胰岛素自身抗体的确定。 8.统计学分析：用GraphPad Prism 4.0软件进行统计学分析。 结果 在糖尿病小鼠的肾小球中有T和B淋巴细胞的浸润,同时有CDllc阳性的树突状细胞浸润,这些CD11c阳性的树突状细胞和CD4和CD8阳性的T细胞有着紧密的接触。在糖尿病小鼠的肾小球中有免疫球蛋白Ig的沉积,同时伴有补体C3的沉积。另外,糖尿病小鼠的血清中含有自身抗体,这些自身抗体能够和正常小鼠的肾小球某些成分起反应,而正常不患病的小鼠血清就不能出现这种反应。随着糖尿病病程的进展,肾脏中免疫改变的出现同时伴随着肾脏的增大和尿白蛋白排泄的增加。TLR4-／-的糖尿病小鼠肾脏组织中也观察到Ig和补体C3的沉积,但比在野生型的糖尿病NOD小鼠肾脏中的沉积减轻。 结论 1.淋巴细胞和自身抗体参与了1型糖尿病肾病。 2.TLR4基因敲除后可以减轻患糖尿病小鼠肾脏中的Ig和补体C3的沉积,表明TLR4在糖尿病早期肾病中起到一定的作用。 3.深刻了解免疫系统在糖尿病肾病中的作用可以更好地确立新的糖尿病治疗方案,对糖尿病肾病的预防起到积极的作用。 背景 TLR通过识别病原体相关分子模式(PAMPs)对外界致病原进行防御,除了在天然性免疫系统中的重要作用,TLR在炎症调节中包括各种无菌性炎症,例如损伤和伤口愈合中也起到了主要作用。TLR在炎症调节中的作用部分取决于TLR可以识别一些被称做损伤相关分子模式(DAMPs)的内源性配体。肝脏不但是代表许多疾病致病细菌PAMPs的主要靶点,而且也是损伤后DAMPs上调的主要器官。 研究表明TLR3能够对来自病毒的双链RNA (dsRNA)来自凋亡或坏死细胞的双链RNA产生反应。死亡的细胞中含有丰富的可以激活TLR(包括TLR3)的各种配体。表达在肝脏中的TLR3很可能是激活天然性免疫和炎症反应的一个介导者。TLR3在急性肝炎中的这些重要作用在以前的研究中没有被详细探讨过。 研究目的 1.建立Con A诱导的小鼠肝炎模型,模拟人类急性爆发性肝炎。 2.探讨了TLR3在没有外源性病毒激活的情况下,在Con A诱导的肝炎中对肝细胞损害的作用。 材料与方法 1.动物：NOD/Caj小鼠,C57BL／6(B6)小鼠,TLR3-／-NOD小鼠,TLR3-／-B6小鼠。 2.肝炎的诱导：ConA被溶于无菌的PBS中,以15mg／kg的剂量静脉注射给小鼠。ConA注射后0、8、24小时给小鼠取血。对照组小鼠注射等剂量的PBS。注射24小时后小鼠被处死。 3.肝功能的评价：血清丙氨酸氨基转移酶用试剂盒测定。 4.肝脏单个核细胞的分离：灌注的肝脏通过200-gauge的不锈钢网后,细胞被悬浮在30%的percoll中,70%percoll被轻轻地打到悬浮液底。密度梯度离心后,收集中间层为肝脏单个核细胞,PBS洗一遍。 5.流式细胞仪分析：除非特别标明,所有用于流式细胞仪分析的抗体购于eBioscience。Fc receptor封闭后,用特定的结合不同荧光素的单克隆抗体进行细胞表面标记；细胞首先被固定,透化处理后,用Cytofix/Cytoperm试剂盒进行染色分析细胞内蛋白；用FACSCalibur的流式细胞仪收集细胞,结果用Flowjo软件分析。 6.组织学检查和免疫染色：按照常规方法对肝脏组织进行HE染色。灌注过的肝脏组织被放在高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液中(PLP)中过夜固定,用OCTTissue-Tek包埋,然后速冻,切成10μm的切片,2%的山羊血清封闭,加入一抗和二抗进行免疫荧光染色,用META510共聚焦显微镜进行观察拍照。 7.肝脏细胞凋亡分析：肝细胞核DNA双链断裂用TUNEL试剂盒分析。 8.血清细胞因子测定：血清中IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-17用Luminex测定。IFN-α的水平用ELISA试剂盒按照操作步骤进行检测。 9.骨髓嵌合体小鼠的生成：通过PBS灌洗小鼠胫骨和腓骨,分别从WT和TLR3-／-供体小鼠获得骨髓细胞。接受骨髓移植的受体小鼠进行照射后,将供体骨髓细胞注射到被照射的小鼠中,建立骨髓嵌合体小鼠模型。 10.受损肝脏组织RNA对Con A刺激的脾淋巴细胞反应：从WT和TLR3-／-小鼠分别获取脾淋巴细胞,加入96孔培养板中,然后加入1μg／ml ConA刺激,并加入通过反复冻融导致的坏死肝脏组织提取的RNA、Con A阴性对照进行刺激。11.统计学分析：所有的数据表示为means±SD或means±SE。统计学分析用GraphPad Prism软件4.0进行分析。 结果 Con A注射后,肝脏单个核细胞和窦状内皮细胞的TLR3表达上升；TLR3-/-小鼠在Con A诱导的肝炎中肝脏损害比野生型小鼠明显减轻。而且,TLR3-/-小鼠的脾淋巴细胞对坏死肝脏组织RNA和Con A刺激的增殖反应比正常小鼠的脾淋巴细胞要弱。为了确定在Con A诱导的肝炎中表达在造血系细胞还是非造血系细胞的TLR3在肝脏损害中的作用,我们生成了骨髓嵌合体小鼠。移植正常小鼠造血系后的TLR3-／-小鼠和移植TLR3-／-小鼠造血系后的正常小鼠在Con A诱导的肝脏损害中都得到相似的保护作用。这表明在非造血系细胞和造血系细胞的TLR3信号通路在介导肝脏损害中都起到重要作用。 结论 1.TLR3信号通路在Con A诱导的肝炎损害中是必要的。 2.在没有病毒感染的情况下,TLR3可以调节炎症反应和适应性T细胞免疫反应。