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姜黄素对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

安伟  
【摘要】: 目的 研究姜黄素(curcumin)预处理对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用及其机制。 方法 1.动物分组及实验模型的建立: 将60只Wistar大鼠随机分为假手术(SO)组、缺血再灌注(I/R)组和姜黄素(CUR)组(n=20)。参照Ohmori方法建立动物模型,阻断肝左、中叶血供40分钟后恢复血供灌注90分钟,灌注完成留取标本。IFR组于术前2h腹腔注射二甲基亚砜(DMSO) 1ml; CUR组于术前2小时按60mg/kg体重腹腔注射溶于DMSO的姜黄素1ml;假手术组仅行麻醉、开腹、游离第一肝门,不阻断肝门血供。 2.肝功血清酶谱测定: 取血样4ml~6ml,在4℃高速恒温离心机中离心后取上层血清,采用Olympus5400全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中ALT、AST、LDH的水平。 3.病理学检查: 将肝脏放入10%的多聚甲醛固定24小时,经历脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、苏木精-伊红(HE)染色等步骤,在光镜下观察肝组织病理学改变; 4.MPO含量的测定: 取部分肝脏,制备10%的肝组织匀浆,按试剂盒说明书步骤操作,测定出各组髓过氧化物酶(MPO)的含量。 5. ELISA法检测肝组织中TNF-α、MIP-2的含量: 将肝组织匀浆放入4℃离心机中高速离心5分钟,取上清液。用BCA法测定组织蛋白浓度,然后分别用大鼠TNF-α、MIP-2的ELISA试剂盒检测组织中TNF-α,MIP-2的含量,结果用[pg/mg (pro)]表示。 6.核蛋白NF-κB(P65)含量测定(Western blot法): 分离提纯核蛋白,用Bradford法测定蛋白浓度。将胶板置入电泳槽中,在70V电压下预电泳30分钟。上样后,先在30V电压下电泳60分钟。然后在100V电压下电泳90分钟。电泳结束后,进行蛋白转膜,将NC膜用5%脱脂牛奶封闭1小时。在4℃条件下用浓度为(1:500)的NF-κB(P65)抗体溶液孵育12小时,PBST洗膜后,置入浓度为(1:5000)二抗溶液中孵育90分钟,PBST洗膜。在暗室内显影、定影。晾干胶片,拍照,用Alpha Innotech 2200半定量分析软件,测定各组的积分吸光度值,结果用histoneH1校正。结果 1.与SO组相比,I/R组血清ALT、AST、LDH均明显增高(P0.05);肝组织匀浆中MPO活性,TNF-α、MIP-2水平及胞核中NF-κB(P65)蛋白表达量均明显升高,差异有统计学意义(P0.05); 2.经姜黄素预处理后,CUR组血清ALT、AST、LDH水平较I/R组均明显下降(P0.05),肝组织匀浆中MPO活性,TNF-α、MIP-2水平及肝细胞核中NF-κB(P65)蛋白表达量均明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。 3.病理切片显示:SO组肝组织形态正常,细胞索排列规整,血窦不扩张,无中性粒细胞浸润;CUR组肝细胞索排列轻度紊乱,部分肝细胞、内皮细胞水肿,出现空泡样变性,汇管区可见轻度中性粒细胞浸润;I/R组肝细胞索结构紊乱,内皮细胞及肝细胞普遍水肿,空泡样变性明显,中央区出现局灶性细胞坏死,血窦内有红细胞淤积,部分肝血窦变窄或消失,汇管区有中性粒细胞浸润。 结论 1.姜黄素预处理能减轻大鼠肝脏的缺血再灌注损伤。 2.在缺血再灌注过程中,姜黄素能够抑制NF-κB活化,下调炎性因子TNF-α、MIP-2的表达。 3.在缺血再灌注过程中,姜黄素能够减轻组织中性粒细胞浸润程度,发挥对肝脏的保护作用。


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