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新型乙型肝炎病毒细胞感染模型的建立

姚永远  
【摘要】: 研究背景 乙型肝炎病毒感染是全球范围内影响人类健康的重大问题,我国是乙型肝炎高流行地区,全国一般人群HBsAg阳性率为9.09%,估计约1.2亿人为慢性HBV感染,占全世界慢性HBV感染人数的1/3。目前人们对HBV及其所致疾病有了相当深入的认识,但由于缺乏合适的动物模型及体外细胞培养系统,乙型肝炎病毒的生物学研究和治疗进展缓慢。现有用于研究HBV的细胞模型主要是人原代肝细胞和肝癌细胞系,前者保留了分化肝细胞的重要细胞学特性,但其缺陷在于在体外培养几天后开始出现肝细胞特殊形态的消失,并且失去了对HBV的感染和复制能力,因而限制了其应用;而后者是通过转染HBV基因组或添加化学试剂而非HBV自然感染的方式进入到细胞中,因此不能用于HBV早期感染过程的研究。为此,本研究旨在通过将经化学诱变剂诱导产生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因突变的HepG2细胞与未携带HBV的人原代肝细胞融合建立一新型细胞系,使其能够自然感染HBV并能体外传代培养,为HBV感染宿主细胞的早期机制的研究,以及病毒侵入人肝细胞后完整的复制过程的研究提供一个强有力的工具。 目的 建立一新型细胞株,使该细胞株既能自然感染HBV又能传代培养,评价杂交细胞对HBV的自然感染能力。 方法 分离培养未携带HBV的人原代肝细胞,与诱导突变的HepG2细胞进行融合得杂交细胞,经HAT培养基筛选,利用胰蛋白酶G显带技术鉴定所得细胞,用含HBV的慢性乙型肝炎患者血清感染杂交细胞(同时感染HepG2作为对照),巢式PCR检测感染后细胞内HBV DNA合成及分泌情况及有无HBV复制中间产物HBV cccDNA,间接免疫荧光检测感染后细胞内HBcAg的表达,电化学发光法检测感染后细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg。结果 成功建立人原代肝细胞与HepG2的杂交细胞,能体外传代培养,染色体核型分析示杂交细胞染色体众数为99条,证实为融合细胞,HBV感染后第4天起,杂交细胞内和培养上清中均能检测到HBV DNA, HBV感染后第3天起,杂交细胞内可以检测到HBV的复制中间产物HBV cccDNA, HBV感染后第4天起,杂交细胞胞浆及部分胞核内HBcAg始终是阳性表达,间接免疫荧光染色呈胞浆弥漫性着色,电化学发光法检测培养上清中HBsAg及HBeAg持续表达;而感染后的HepG2细胞检测结果均为阴性。结论 成功建立了一个兼具有人原代肝细胞和HepG2细胞遗传特性的杂交细胞株,该杂交细胞株可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染,并能传代培养,可以进一步用作研究HBV感染的体外细胞模型。


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