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整合素αvβ6在胃癌AGS细胞恶性生物学行为中的作用研究

刘松  
【摘要】: 目的 探讨整合素αvβ6在胃癌AGS细胞增殖、凋亡和化疗耐药等恶性生物学行为中的作用及相关机制。 方法 实验分两部分。 第一部分,培养细胞至对数生长期后分3组处理。对照组:不做特殊处理;10D5组:收集细胞重悬于RPMI 1640中,向细胞悬液加入αvβ6单克隆抗体10D5,使其终浓度为0.1mg/mL,冰浴30min使其充分作用后置培养箱培养6h,PBS清洗终止反应;IgG2a组:用10D5阴性对照剂鼠IgG2a以相同浓度处理,方法同10D5组。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blotting检测caspase-3蛋白的表达情况以研究整合素αvβ6在胃癌AGS细胞增殖和凋亡中的作用。 第二部分,培养细胞至对数生长期后分4组处理。对照组:细胞贴壁后(6h)换液,加入含特定浓度5-FU的培养基培养24h;10D5组:向细胞悬液加入10D5,使其终浓度为0.1mg/mL,冰浴30min使其充分作用后置培养箱培养6h,换液加入含特定浓度5-FU的培养基培养24h;IgG2a组:加入10D5对照剂IgG2a后用5-FU处理,试剂浓度和方法同10D5组;PD98059组:细胞贴壁后(6h)换液,加入含5-FU和终浓度为20μmol/L PD98059的培养基培养24h。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blotting检测Bcl-2和caspase-3蛋白的表达情况以研究αvβ6是否可介导胃癌AGS细胞对5-FU的耐受及β6-ERK直接通路在其中的作用。其中,MTT选取5-FU浓度为0.5mmol/L,流式和Western blotting选取5-FU浓度为0.2mmol/L。统计方法采用单因素方差分析和LSD检验,P0.05表示差异有统计学意义。 结果 第一部分: 1.经MTT法检测,用10D5封闭αvβ6后,细胞的存活率下降至(73.74±1.7)%(P0.05),而IgG2a处理组(99.4±2.9)%与对照组相比无明显差异(P0.05)。 2.用流式细胞仪检测各组细胞并用WinMDI2.9软件分析得出,对照组、10D5组、IgG2a组的凋亡率分别为(1.93±0.09)%、(11.82±0.45)%、(2.06±0.04)%。10D5组细胞的凋亡率与对照组相比明显增加,差异有统计学意义(P0.05);IgG2a组和对照组相比无统计学差异(P0.05)。 3.经半定量光密度分析,caspase-3表达水平组间差异有统计学意义,10D5组表达水平大于对照组(P0.05)。IgG2a组与对照组相比,caspase-3表达水平无统计学差异(P0.05)。 第二部分, 1.5-FU毒性检测:用含5-FU浓度为0.005、0.05、0.5、5mmo1/L的培养基孵育24小时后,胃癌AGS细胞抑制率分别为(17.31±0.78)%、(19.55±0.64)%、(47.56±3.23)%、(80.87±3.4)%。 2.经MTT法检测,对照组、10D5组、IgG2a组、PD98059组的抑制率分别为(28.11±2.7)%、(84.49±1.6)%、(31.44±5.2)%、(86.72±5.2)%。10D5组、PD98059组的抑制率均明显大于对照组,差异有统计学意义(P0.05);IgG2a组和对照组相比无显著差异(P0.05)。 3.用流式细胞仪检测各组细胞并用WinMDI2.9软件分析得出,对照组、10D5组、IgG2a组、PD98059组的凋亡率分别为(6.63±1.4)%、(30.55±2.4)%、(8.13±1.3)%、(35.99±4.0)%。10D5组、PD98059组的凋亡率与对照组相比均明显增加,差异有统计学意义(P0.05);IgG2a组和对照组相比无显著差异(P0.05)。 4.经半定量光密度分析,10D5组、PD98059组的caspase-3表达水平均大于对照组(P0.05),而Bcl-2表达水平小于后者(P0.05);IgG2a组与对照组相比,caspase-3和Bcl-2表达水平无统计学差异(P0.05)。 结论及意义 1.胃癌AGS细胞表面的αvβ6被特异性抗体封闭后,细胞增殖减慢,凋亡增加,caspase-3表达水平上调。表明αvβ6在AGS细胞增殖和抗凋亡过程中发挥作用。 2.胃癌AGS细胞表面的αvβ6被特异性抗体封闭后再用5-FU诱导细胞凋亡,与对照组及鼠IgG2a组相比,细胞的增殖减慢,凋亡增加,caspase-3表达水平上调而Bcl-2表达水平下调。表明αvβ6可通过上调Bcl-2表达抑制5-FU诱导的胃癌细胞凋亡,促进细胞增殖,介导细胞对5-FU耐受的产生。 3.用PD98059阻断ERK功能后,胃癌AGS细胞的增殖减慢,凋亡增加,caspase-3的表达水平上调而Bcl-2表达水平下调,表明PD98059消除了αvβ6介导的胃癌细胞对5-FU的耐受作用,从而证实β6-ERK直接通路在此过程中发挥重要作用。 综上,本实验证实了整合素αvβ6在胃癌AGS细胞增殖、抗凋亡和化疗耐药等恶性生物学行为中的作用,简单探讨了其作用机制,为胃癌机制研究及治疗提供了新的思路。相信随着研究的不断深入,以αvβ6及相关分子为靶点的胃癌治疗将有广阔的前景。


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