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大肠杆菌操纵子改造及其应用初步研究

王俊姝  
【摘要】: 代谢工程中的核心之一是代谢途径的调控。原核生物大多数基因以操纵子的形式存在,功能相关的基因及调控序列形成一个转录单元。操纵子是原核生物基因基因调控的最重要的机制。而启动子是DNA上RNA聚合酶的结合位点,是转录的起始位点,在基因的表达过程中起到重要的调节作用。启动子的与RNA聚合酶的结合强度以及其与各种转录因子的相互作用直接影响下游基因的转录水平以及在细胞内的表达水平。操纵子是基因表达调控的重要机制,而启动子是操纵子中的重要生物学元件,本实验从操纵子结构以及启动子在操纵子中的分布对基因表达的调控作用进行了初步研究。 在低拷贝质粒pCL1920上,构建了一个无启动子调控的绿色荧光蛋白编码基因(gfp)和β-半乳糖苷酶编码基因(lacZ)组成的操纵子,操纵子5′端有一个启动子克隆区域,便于快速克隆目的启动子。利用该操纵子,可以绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶作为信号分子监测启动子的启动强度,即其在转录水平对操纵子中下游基因的调控作用。为启动子改造提供了分子生物学工具,并利用该系统成功克隆了大肠杆菌内fic、katE、spc、rpoS、nlpD启动子以及代谢工程中常用的trc启动子的核心区域,同时表征了上述启动子在体内的启动下游基因表达特性。根据绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶的表达水平,Fic,katE启动子启动强度较弱,而spc、rpoS、nlpD启动子较强,其中trc启动子的核心区域的启动能力最强,上述不同强度的启动可适用于在代谢工程中外源基因不同的表达水平。另外,利用操纵子中两个报告基因探索了操纵子中多拷贝启动子以及基因间启动子对基因转录水平的调控作用。通过化学合成五个重复拷贝的trc核心区启动子MTrc并将MTrc克隆在上述操纵子中,其启动强度是单拷贝trc核心区启动子强度的3.47倍;通过整合PCR得到trc、spc启动子串联的trc-spc启动子,并将trc-spc启动子克隆在上述操纵子中,其启动强度强于trc和spc分别单拷贝的启动强度。通过增加操纵子中的启动子拷贝数可以增加下游基因的转录水平,启动子结构中转录必须序列较编码基因更小,因此,增加启动子的拷贝数可以以最小的代谢负担增加基因的表达水平,为代谢工程中基因的精确调控的分子生物学元件研究提供分子生物学工具。 将4-羟基丁酸代谢途径中三个关键基因克隆在lac启动子下游,构建一个非天然存在的由琥珀酸到4-羟基丁酸代谢途径操纵子,利用产琥珀酸的大肠杆菌株QZ1111和XL1 Blue△sdhA以葡萄糖为发酵底物积累聚-3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸共聚物。探索该合成操纵子在大肠杆菌中积累聚3-羟基丁酸,4-羟基丁酸酯的可行性。


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