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ADC病人HIV-1gp120基因多样性分析及对U87细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响

闫玉芬  
【摘要】: 目的 影响ADC发病的主要因素有HIV-1病毒的致病性、机体的神经易感性及免疫抑制的水平。研究表明大脑及脑脊液中HIV病毒载量与ADC的发生并非总是有关,这说明ADC的发生可能与HIV本身的基因及生物学活性有关。鉴于HIV-1gp120在病毒与宿主细胞结合和融合中发挥不可替代的作用,本研究的第一部分拟通过对来源于2例ADC病人各6个组织的共60株HIV-1gp120序列进行基因多样性与生物学活性位点分析,对HIV-1gp120基因多样性和生物学活性与ADC发病的关系作出初步判断。 HIV-1致ADC发病的机制尚不清楚,但可以肯定的是它可以通过刺激胶质细胞或巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β引起神经元细胞损伤。鉴于HIV-1病毒载量与ADC的发生并非总是有关,本研究的第二部分拟通过分析不同病人不同组织来源基因不完全相同的HIV-1gp120诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力,来探讨HIV-1gp120基因差异是否与其刺激细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力有关,从而为ADC阐述发病机制提出新观点,为ADC的预防与控制提供新思路。 方法 1.以HIV-1B标准株HXB2 gp120基因序列基因组DNA序列作为模板,应用Primer 5.0软件设计引物,巢式PCR法扩增源自两例ADC病人共12个不同组织的HIV-1gp120序列,PCR产物经TA克隆后,转化至大肠杆菌DH5α,经蓝白斑、氨苄青霉素筛选及测序后,每个部位选取5个HIV-1gp120阳性克隆进行序列分析。通过对来自于两例ADC病人不同组织的HIV-1gp120序列分别进行系统发育树、ds/dn比值、糖基化位点、V3环关键位点氨基酸等分析,以探讨HIV-1gp120与ADC发病的关系。 2.随机选取源自两例ADC病人外周组织、中枢神经组织的HIV-1gp120克隆各一个(共4个克隆),PCR扩增gp120基因,经TA克隆、蓝白斑及氨苄青霉素筛选,提取阳性质粒,双酶切后的gp120片段与经过同样双酶切的逆转录病毒表达载体MSCV-IRES-GFP连接,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选HIV-1gp120阳性表达载体,经双酶切和测序证实。然后将逆转录病毒表达载体与pUMVC、pCMV-VSV-G共转染293T细胞,免疫荧光显微镜观察逆转录病毒载体的表达、免疫组化实验检测HIV-1gp120的表达。收获免疫荧光检测阳性的重组逆转录病毒悬液,经逐孔稀释法测定其感染滴度,然后感染U87细胞,荧光显微镜检测重组逆转录病毒蛋白的表达,免疫组化实验检测HIV-1gp120的表达,ELISA法测定细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS软件分析测定结果。 结果 1.获得了来源于两例ADC病人各6个组织共60个HIV-1gp120阳性克隆,并经测序证实,BLAST分析均为HIV-1Bgp120序列。 2.构建了每例ADC病人来源的各6个组织共30个HIV-1gp120基因克隆的系统发育树,由系统发育树可见,不同组织来源的HIV-1gp120基因位于不同的系统发育树进化枝上,不同组织来源的HIV-1gp120基因克隆也可以存在交叉现象。 3.与HIV-1B标准株HXB2 gp120相比,第一例ADC病人来源的HIV-1gp120其各自的ds/dn=1.1744±0.0348(p<0.001);第二例病人体内来源的所有HIV-1gp120基因序列的ds/dn=0.8222±0.2086(p<0.001);两个病例来源的HIV-1gp120基因序列的ds/dn具有显著性差别(p<0.001)。 4.以HIV-1B标准株HXB2gp120的糖基化位点为标准,第一例ADC病人来源HIV-1gp120序列糖基化位点相对比较保守,第二例ADC病人来源的HIV-1gp120序列糖基化位点变异较大。 5.根据现有的资料,可以预测感染两例ADC病人大脑组织的HIV-1病毒均为CCR5受体使用型、巨噬细胞嗜性、非合胞体诱导型毒株。 6.构建了4个HIV-1包膜糖蛋白gp120的逆转录表达载体A1/MIG、B1/ MIG.A2/MIG.B2/MIG,双酶切鉴定目的片段和载体分别为1.44kb和6.8kb,并经测序证实。对四个表达载体中的HIV-1gp120进行分析,发现四株HIV-1gp120序列存在基因差异,其中A1/MIG的V3环序列与其他三株序列差异较大。 7.荧光显微镜观察结果显示共转染MSCV-IRES-GFP.pUMVC及pCMV-VSV-G的293T细胞及感染重组逆转录病毒的U87细胞中均有绿色荧光信号产生。逐孔稀释法测定重组逆转录病毒的滴度约为106/ml。 8免疫组化实验显示转染A1/MIG、B1/MIG、A2/MIG、B2/MIG表达载体的293T细胞及感染HIV-1gp120阳性重组逆转录病毒的U87细胞中均有HIV-1gp120阳性细胞出现。 9.ELISA测定重组逆转录病毒感染细胞上清中TNF-α、IL-1β含量,发现HIV-1gpl20阳性重组逆转录病毒诱导细胞分泌的TNF-α、IL-1β量高于HIV-1 gpl20阴性重组逆转录病毒(p<0.001);第一例ADC病人外周组织来源的HIV-1gpl20诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β的量高于其它3个组织来源的HIV-1gpl20(p0.001),而其他3个组织来源的HIV-1gp120诱导分泌的TNF-α、IL-1β的量差别无统计学意义(p>0.10)。 结论 1.HIV-1 gp120的基因多样性和生物学活性位点改变与ADC的发病机制可能存在一定关系。 2.HIV.1gp120能增强胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力。 3.HIV-1gp120基因序列尤其是V3环序列能影响其刺激胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力,CCR5受体使用型的HIV-1gp120诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β的能力高于非CCR5受体使用型的HIV-1gp120。


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