壳聚糖基角膜内皮组织工程载体支架的制备及性能评价

【摘要】：目的：在我国,角膜病仅次于白内障是第二大致盲眼病,我国的单眼和双眼角膜盲患者共有约400万人,其中80%可以通过角膜移植手术复明,但由于角膜供体来源短缺,目前我国每年能完成的角膜移植手术仅约5000例。随着组织工程技术的迅猛发展以及角膜细胞体外培养方法的建立,利用组织工程技术构建人工角膜为治疗角膜盲提供了新的途径和方法,也成为当前研究的热点之一。壳聚糖是甲壳素脱乙酰后得到的聚阳离子生物多糖,安全、无毒、具有良好的组织相容性和生物降解性、降解产物可被人体吸收。近年来,壳聚糖在组织工程领域的研究也越来越受到人们的重视,以其为主要成分制备载体支架用于皮肤组织工程、骨骼组织工程、神经组织工程、血管组织工程等的实验研究已有报道；另外,以壳聚糖复合胶原、透明质酸或硫酸软骨素等制备的共混膜在构建人工角膜的研究中也得到应用。本研究以克服高脱乙酰度壳聚糖共混膜硬度高、植入体内降解速度慢等缺点为切入点,首次选择脱乙酰度50%的水溶性壳聚糖为基本材料,采用共混的方法旨在制备出理化性质优异、组织相容性良好、适合角膜内皮细胞贴附生长的共混膜,为该种共混膜作为角膜内皮组织工程载体支架的可行性提供理论依据。 方法：1、参照组织工程医疗产品行业标准对实验室制备的水溶性壳聚糖(Cts)的水分、灰分、重金属含量、粒度、pH、细胞毒性等性质进行测定；2、以水溶性壳聚糖为主体,按照体积比9:1:0.1、8:2:0.1、7:3:0.1的比例与明胶(Gel)、硫酸软骨素(CS)进行共混制备出三组共混膜；测定共混膜的含水量、通透性、透光率、细胞毒性等性质,评价兔角膜基质细胞在共混膜上贴附生长性能,筛选出一组共混膜作为进一步研究的对象；3、从体外酶解-皮下、肌肉植入-眼前房植入三个层面评价共混膜的生物降解性和组织相容性；4、在体外以共混膜为载体支架构建人工角膜内皮,考察兔角膜内皮细胞在共混膜上的贴附牢固程度及生长情况,研究共混膜与角膜内皮细胞的相容性,并制备曲率共混膜。 结果：1、实验室制备的水溶性壳聚糖符合组织工程和生物医用材料对植入体内应用的材料的要求。细胞毒性试验显示水溶性壳聚糖对L929细胞完全没有毒性,而且对其生长具有一定的促进作用,具有良好的细胞相容性。2、通过对三组共混膜性质的比对,发现体积比Cts:Gel:CS=9:1:0.1的共混膜含水量合适、透光率优异、通透性良好、无细胞毒性、适合兔角膜基质细胞生长,可作为角膜载体支架材料。3、Cts-Gel-CS共混膜比单纯壳聚糖膜体外降解速度快,而且组织中炎症反应较轻,具有良好的生物降解性和组织相容性。其中,共混膜在大鼠背部皮下和股部肌肉内60天左右基本被降解吸收；在兔眼前房内,观察期内无明显的炎症反应,植入后2个月共混膜基本被吸收。4、Cts-Gel-CS共混膜与角膜内皮细胞相容性良好,曲率共混膜也具有良好的透明性和一定机械强度,为后续动物移植实验奠定了基础。 结论：实验室自制的脱乙酰度50%的水溶性壳聚糖符合组织工程和生物医用材料对植入体内应用的材料的要求；以该种水溶性壳聚糖为主要材料,按体积比Cts:Gel:CS=9:1:0.1,与明胶、硫酸软骨素进行共混制备的膜片含水量合适、透光率优异、通透性良好、细胞毒性为0级、适合兔角膜基质细胞和内皮细胞生长,在大鼠背部皮下、股部肌肉和兔眼前房内组织反应比较温和,炎症反应较轻,具有良好的组织相容性。总之,该共混膜具备作为组织工程角膜内皮载体支架的基本条件,通过对该共混膜的进一步研究,有望在构建组织工程活性人工角膜方面发挥积极作用。