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四种细胞色素P450酶在半滑舌鳎繁殖生理机能中的作用研究

陈彩芳  
【摘要】: 本文首次克隆得到半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) P450c17-I、P450c17-Ⅱ全长cDNA,系统研究了P450c17 (-Ⅰ、Ⅱ)、P450c19 (A, B) mRNA时空表达,并首次结合性腺发育、血清T及E2含量,探讨这几种酶类在雌雄半滑舌鳎繁殖周期中的分子生理机制。 1.人工养殖半滑舌鳎卵巢发育及产卵类型研究 人工养殖半滑舌鳎成熟鱼卵巢经历Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期,再到重复发育Ⅱ期;人工养殖条件下,3-5月份大部分鱼类处于Ⅱ期卵巢,6月份开始,卵母细胞内开始沉积卵黄颗粒,9-11月份,卵黄颗粒充盈整个胞质,基本达到生长成熟,排卵后至翌年2月份,卵巢进入退化吸收期或重复发育Ⅱ期;繁殖期GSI达到最高峰;产卵后或重复发育Ⅱ期,GSI显著下降,此时HSI显著升高至全年最高峰;半滑舌鳎在一年中只有1个繁殖期,进行分批产卵。 2.半滑舌鳎血浆性类固醇激素水平的周年变化 采用125I放射免疫法测定雌鱼血浆E2、T含量,发现其与卵巢发育过程(GSI)基本相一致。繁殖季节,E2、T为全年最高值(P0.05);进入越冬期后,两者含量均下降;到饲育期继续大幅下降(P0.05);至促熟期,E2显著升高(P0.05),而T降至本法检测不到。结果表明,雌鱼血浆E2含量的规律性变动,与卵巢发育、卵黄形成是密切相关的;T作为E2前体,其变化趋势与卵巢发育具有相关性,是卵巢发育到一定阶段所必需。 雄鱼血浆T、E2含量与精巢发育(GSI)基本一致。最高值出现在繁殖季节,之后进入11~翌年1月份,两者含量均显著下降(P0.05);2~4月份T含量略微上升,E2含量则继续下降,之后到5~7月份,T、E2含量均显著升高(P0.05)。结果表明,睾酮对精细胞的生长发育有直接作用,能够促进精子的发生和成熟。 3.半滑舌鳎两种P450c19时空表达分析 半滑舌鳎两种芳香化酶(P450arom A、P450aromB)空间表达发现,P450aromA只在性腺表达,P450aromB只在脑、鳃表达。P450aroms在各个发育期雌雄鱼的性腺和脑内均有表达。卵巢P450aromA表达模式与血清E2、T变化趋势一致,暗示P450aromA在卵巢发育和卵母细胞生长中起到了重要作用。而精巢内P450aromA时间表达却与E2、T变化趋势呈无相关性。P450aromB时间表达发现,退化吸收期雌鱼脑内表达量显著升高至全年最大值;排精后雄鱼脑内也出现类似结果。这些结果表明雌性繁殖周期很大程度上受CYP19A调控外,还受CYP19B调控。 4.新型程序化设计简并引物克隆半滑舌鳎CYP17基因片段 采用一种新的简并引物设计方法—CODEHOP法来克隆半滑舌鳎CYP17基因。该法结合NCBI、Blastp、BIockMaker、CODEHOP等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,程序性设计半滑舌鳎CYP17基因的CODEHOP引物,从半滑舌鳎卵巢组织中成功克隆了CYP17基因,该基因片段与其它物种CYP17家族具有较高同源性,经鉴定,该基因属于鱼类CYP17基因群。实验结果表明,程序性设计简并引物较传统简并引物特异性更高,假阳性率少,更有利于实验成功。 5.半滑舌鳎P450c17-Ⅰ克隆及时空表达分析 本研究克隆了P450c17-Ⅰ全长cDNA,为2469 bp,编码509个氨基酸。同时也得到一条较短cDNA,长1742bp,推测是经多聚腺苷酸化而来。P450c17-Ⅰ酶与胖头鱼岁、斑马鱼、日本鳗鲡、罗非鱼、三刺鱼、青鳉、白斑角鲨、鸡、鼠和人的P450c17-Ⅰ酶具有高同源性。空间表达发现:P450c17-Ⅰ主要在性腺内表达,其次是脑,在胃、肠、鳃、脾脏、肾、头肾、心内检测到弱带。性腺和脑内P450c17-Ⅰ时间表达模式表明其表达具有卵巢发育正相关性。另结合雌鱼血清T和E2水平,表明P450c17-Ⅰ在类固醇激素途径发生转变中起到了重要作用。 6.半滑舌鳎P450c17-Ⅱ克隆及时空表达分析 本研究克隆了P450c17-Ⅱ全长cDNA,为2102bp,编码524个氨基酸。半滑舌鳎P450c17-Ⅱ酶,与其他物种P450c17-Ⅱ酶同源性较其他物种P450c17-Ⅰ酶同源性高。时空表达发现其只在性腺、头肾、脑内表达。卵巢和脑内P450c17-Ⅱ时间表达模式都具有发育正相关性,而P450c17-Ⅱ在精巢内的时间表达却与性腺发育呈负相关。本研究通过性腺、脑、头肾内P450c17-Ⅱ表达,结合性腺发育期、血清中E2、T,探讨P450c17-Ⅱ与性腺发育关系,为国内鲆鲽鱼类繁殖生理学提供理论基础。


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