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HSP70介导细胞氧化应激反应及扇贝多肽的神经保护作用研究

叶俊丽  
【摘要】: 氧化应激参与神经退行性疾病和神经元缺血损伤的发生发展。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)引起神经细胞损伤的同时,细胞内会启动相应抗损伤应激反应。热休克蛋白70家族(heat shock protein70, HSP70)是多种应激原诱导细胞产生的一组保守性蛋白,HSP70(HSP72)和葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)是分别位于胞浆和内质网的HSP70家族成员。研究表明,HSP70(HSP72)除作为蛋白质分子伴侣外,还可直接抗凋亡和抗DNA损伤。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和生长抑制DNA损伤诱导蛋白(growth arrest and DNA damage inducible protein, GADD)是可被ROS激活并分别与细胞凋亡和DNA损伤关系密切的应激因子,神经细胞氧化应激损伤中HSP70的保护作用是否与MAPK和GADD有关尚不明确。GRP78是内质网应激反应(Endoplasmic Reticular Stress, ERS)的分子伴侣标志,过强过久ERS也可启动细胞凋亡。以GRP78表达增加为标志的ERS如何介导氧化应激损伤尚需探讨。抗氧化剂可拮抗神经细胞氧化损伤,目前关于海洋活性物质抗神经细胞氧化损伤的研究甚少。课题组前期研究表明,从海洋生物栉孔扇贝(Chlamys farreri)中提取的活性物质——扇贝多肽(polypeptide from Chlamys farreri, PCF)具有抗氧化作用,在大鼠大脑中动脉缺血模型中发挥神经保护作用,但其分子机制还不明确。 基于以上背景,本研究采用MTT、ESR、透射电镜、荧光染色、Western blot、RT-PCR、酶化学和流式细胞术等研究方法,针对HSP70、GRP78介导神经细胞氧化应激和PCF的作用分三部分进行如下研究:首先,建立过氧化氢(H202)致人成神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)氧化应激损伤模型,检测损伤后不同时间HSP70、MAPK、GADD153和GADD45β的表达;HSP70表达诱导剂GGA或抑制剂quercetin预孵育细胞后再行损伤,观察MAPK和GADD的表达变化,研究HSP70在H202所致SH-SY5Y细胞氧化应激损伤中的作用。其次,观察内质网超微结构、GRP78/Bip及GADD153/CHOP蛋白表达,明确H2O2是否能引起ERS。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸和ERS抑制剂4-PBA分别预处理细胞再进行损伤,检测细胞活性、细胞凋亡、细胞内ROS水平和内质网途径相关凋亡调控分子GRP78、CHOP、JNK和Bcl-2的表达,探讨ERS在氧化损伤致神经元凋亡中的作用。(3)观察细胞活性、ROS、脂质过氧化、DNA氧化及抗氧化酶活性,探讨PCF的抗氧化特性;检测MAPK、GRP78、CHOP/GADD153、HSP70及Bcl-2表达,研究PCF的抗凋亡分子靶点。 研究结果如下:①对正常对照组相比,H2O2模型组细胞活性降低,胞内ROS水平、HSP70、GADD153/CHOP、GADD45β表达及ERK1/2和JNK磷酸化水平增加,上述效应呈时间依赖性;与H2O2模型组相比,GGA诱导HSP70高表达组细胞活性升高,DNA损伤和细胞凋亡减轻,ERK1/2、JNK磷酸化及GADD153表达减弱,GADD45P表达增强;②对正常对照组相比,H2O2模型组细胞内质网扩张脱颗粒,GRP78和CHOP表达增加,其表达呈时间依赖性;与H2O2模型组相比,NAC和4-PBA预处理组细胞活性增加,细胞凋亡减少,GRP78和CHOP表达减少,JNK活化减弱,Bcl-2表达增加;③与H2O2模型组相比,PCF预处理能提高损伤细胞活性,减少ROS和细胞凋亡,抑制脂质过氧化及DNA氧化损伤,提高GSH、SOD、CAT、GPx活性和细胞总抗氧化能力,抑制JNK磷酸化及GRP78和CHOP表达,上调HSP70和Bcl-2表达。 以上结果表明:①神经细胞氧化损伤后HSP70介导的抗凋亡抗DNA损伤作用与抑制ERK1/2和JNK活化、调控GADD45β和GADD153基因表达有关;②氧化应激可诱导ERS,GRP78/CHOP/JNK/Bcl-2参与H2O2经内质网途径激活的细胞凋亡;③PCF的神经保护作用与其抗氧化特性和抗凋亡有关,PCF可上调HSP70和抑制ERS, CHOP/JNK/Bcl-2是其抗凋亡分子靶点。 本研究初步探讨了HSP70家族介导神经细胞氧化应激的分子机制和PCF的神经保护作用。创新之处有:①ESR技术检测SH-SY5Y细胞损伤后ROS的经时变化;②GADD45β和GADD153是HSP70参与神经细胞DNA损伤修复的靶向下游分子;③HSP70/ERS/CHOP/JNK/Bcl-2是海洋抗氧化剂PCF神经保护作用的分子靶点。研究有待继续深入的方面有:①构建特异的HSP70高表达和沉默细胞株研究其功能;②HSP70与MAPK、GADD的直接相互作用或间接调控机制;③H202经ERS致细胞凋亡的下游途径;④PCF药代动力学和对原代神经元的抗凋亡分子机制。


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