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对虾和刺参敏感免疫学指标的筛选和评价

常杰  
【摘要】:针对目前已报道的增强水产动物免疫功能的物质较多,但对免疫增强剂使用效果的评价尚无统一标准,需建立一套稳定的免疫增强剂的评价体系。本论文比较研究了不同作用途径的免疫增强剂(β-葡聚糖和甘草酸)、以及不同的作用方式(投喂免疫增强剂、攻毒和饥饿)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和刺参(Apostichopus japonicus Selenka)的非特异性免疫反应和抗病力的影响,分析了十余种目前在水产动物中反映免疫状态的常用指标,以期从中筛选出凡纳滨对虾和刺参的敏感免疫学指标,为建立相关免疫增强剂的评价体系提供科学依据。主要研究内容和结果如下: 1.通过实验筛选了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对两种免疫增强剂β-葡聚糖(β-glucan)和甘草酸(glycyrrhizic acid)敏感的免疫学指标。设立了连续投喂实验组,隔天采样测定对虾的免疫指标,结果表明饲料中添加0.2%葡聚糖能显著提高酚氧化酶活力(Apo)、呼吸爆发活性(RB)、溶血活性(Hemolysin activity)、酸性磷酸酶(ACP)活性、碱性磷酸酶(AKP)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮合酶(NOS)活性和血清蛋白(Plasma protein)含量,出现显著升高的时间集中在投喂后3~9天然后保持较高水平(P0.05);饲料中添加0.06%甘草酸能显著提高血细胞密度(THC)、酚氧化酶活力(Apo)、呼吸爆发活性(RB)、碱性磷酸酶(AKP)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮合酶(NOS)活性、血清蛋白(Plasma protein)含量,出现显著升高的时间集中在投喂后7~16 d然后保持一定水平(P0.05)。 2.通过实验筛选了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对溶藻弧菌(V. alginolyticus)感染敏感的免疫学指标。在投喂两种免疫增强剂18 d后连续采样,测定对虾的免疫指标。结果表明结果表明:饲料中添加0.2%葡聚糖、0.06%甘草酸18 d后可显著提高凡纳滨对虾弧菌攻毒后的成活率(P0.05)。感染弧菌后12~72 h内,总血细胞数(THC)、溶血活力(Hemolysin activity)、一氧化氮合酶(NOS)活性、酚氧化酶(PO)活性、呼吸爆发(RB)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性、碱性磷酸酶(AKP)活性和血清蛋白(Plasma protein)含量随弧菌感染和对虾死亡出现一定规律性的变化。相关性分析显示,成活率和THC、PO、SOD、NOS及AKP极显著相关(P0.01),可以用这几个指标较为直接的反应凡纳滨对虾抗溶藻弧菌感染的水平。 3.以体重12.13±1.61 g凡纳滨对虾为实验材料,分别用体外投喂、体内注射的方式感染白斑综合症病毒(WSSV),连续采样研究对虾免疫指标的动态变化。实验结果表明,和对照组相比感染病毒后总血细胞数(THC)、溶血活力、血清蛋白含量(Plasma protein)、酸性磷酸酶(ACP)、凝集活力均显著下降(P0.05);而超氧化物歧化酶(SOD)活力、一氧化氮合酶(NOS)活力具有相类似的趋势,略升高后下降;呼吸爆发(RB)活力、碱性磷酸酶(AKP)活性、酚氧化酶(PO)活力在24-48 h显著上升,濒死对虾的最高。通过和死亡率的相关性,筛选出在WSSV攻毒初期敏感的免疫学指标:SOD、NOS、RB、AKP、PO,这5个指标能较好反映对虾的免疫状态,可用来评价凡纳滨对虾的抗白斑病毒的能力。 4.饲料中添加0.2%β-葡聚糖和0.02%甘草酸对刺参各免疫指标变化的影响不同,在投喂两种免疫增强剂45 d期间连续采样,与对照组比较表明,β-葡聚糖和甘草酸在不同时间段提高了刺参体腔细胞的TCC, PC和ISAP,而且刺参体腔液中LSZ, ACP, AKP, SOD和NOS活性均显著提高(P0.05)。根据出现显著升高的时间集中且保持一定水平的原则,从中筛选出刺参对这两种免疫增强剂敏感的免疫学因子为PC, LSZ, SOD和NOS。 5.在饲料中分别添加0.2%β-葡聚糖和0.02%的甘草酸养殖刺参45 d后,人工感染灿烂弧菌(Vibrio splendidus),分别在第0、5、10和15 d检测刺参TCC,PC, ISAP, LSZ, ACP, AKP, SOD, NOS活性的变化,并记录刺参的累积发病率。感染灿烂弧菌后,除AKP活性在整个感染过程中没有出现显著性变化,刺参的各项免疫指标随感染时间的推移而发生改变,感染后第5 d各免疫指标开始下降,从第10 d开始恢复,至第15 d时几乎达到感染前的水平。结论表明:饲料中添加β-葡聚糖和甘草酸能通过改善刺参体腔液中免疫指标(TCC、PC、ISAP、LSZ、ACP、AKP、SOD和NOS)来增强刺参抵抗灿烂弧菌的能力。在本实验条件下,由刺参的免疫指标变化与感染后时间的回归分析可得,刺参体腔液LSZ和SOD活性、体腔细胞PC和TCC可以作为刺参对感染灿烂弧菌和投喂这两种免疫增强剂敏感的免疫指标。 6.在饲料中分别添加0.2%β-葡聚糖和0.02%的甘草酸养殖刺参29 d后,进行为期20 d饥饿实验,研究这两种免疫增强剂对饥饿刺参免疫力的影响。分别在饥饿第0、5、10、15和20 d检测刺参TCC, PC, ISAP, LSZ, ACP, AKP, SOD和NOS活性的变化。结果表明,投喂基础饲料、葡聚糖和甘草酸饲料刺参在饥饿期间体腔细胞总数均有不同程度的变化。对照饥饿组在短时间饥饿5 d过程中其细胞总数不但没有下降,反而有上升的趋势。而投喂葡聚糖和甘草酸刺参在整个饥饿期间虽随饥饿时间呈逐渐下降的趋势,但相对于对照饥饿组来说,其体腔液细胞总数在饥饿短期内下降的幅度要小。刺参在饥饿胁迫下,可引起其体腔细胞和体腔液酶活性的变化,而投喂免疫增强剂可在短期饥饿减缓其变化幅度。而在本实验条件下,由回归分析可得到,投喂三种饲料对饥饿刺参的免疫指标变化与饥饿时间关系密切,可用SOD, NOS和ACP活性来评价免疫增强剂在饥饿胁迫下刺参的敏感的免疫指标。


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