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油酰壳聚糖纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究

张静  
【摘要】:当前,癌症严重危害人类健康,癌症的治疗一直是医学领域研究的热点。化学药物治疗(化疗)是有效的癌症治疗手段之一,但化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时对人体正常细胞也有损伤,毒副作用大,且肿瘤细胞易产生多药耐药,最终导致治疗效果不理想。纳米技术的发展使得纳米给药系统在癌症治疗领域显示出巨大潜力,纳米药物载体由于可以改善药物的溶解性,增强药物的靶向性,并对药物进行缓控释而受到广泛关注。壳聚糖(chitosan, CS)因具有良好的生物相容性和生物可降解性而被广泛用于药物载体的研究,其中,疏水改性壳聚糖纳米粒是一类极具应用前景的抗肿瘤药物载体。本论文利用油酰氯对壳聚糖进行疏水改性得到油酰壳聚糖复合物(oleoyl-chitosan, OCS),通过O/W乳化法制备OCS纳米粒,并对OCS纳米粒作为抗肿瘤药物载体的可行性进行了研究。 利用盐酸降解法制备了不同分子量的CS样品,采用油酰氯和CS反应的方法制备了不同取代度的OCS,红外光谱和核磁光谱检测证明油酰基团成功引入CS分子中。取代度分析表明,制备得到的OCS样品的取代度分别为5%,11%和27%。采用O/W乳化法制备得到OCS纳米粒。不同取代度OCS纳米粒的平均粒径呈正态分布,分布范围较窄,且纳米粒的平均粒径随油酰基取代度的增大而减小。不同分子量的OCS纳米粒近似球形,形态完整,且纳米粒的粒径随CS分子量的增大而增大。 溶血实验表明,不同实验条件下OCS纳米粒溶液的溶血率均低于5%,符合生物医用材料对溶血率的要求。随着OCS取代度的增加,纳米粒对牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)及小牛血清(bovine calf serum, BCS)的吸附量减少。OCS纳米粒对BSA及BCS蛋白的吸附具有一定的时间和浓度依赖性:随着反应时间的延长,OCS纳米粒对BSA及BCS总蛋白的吸附量逐渐增加,在前8h内基本达到吸附平衡;随着ocs纳米粒浓度的增大,OCS纳米粒对蛋白的吸附量也相应增加。不同实验条件下,OCS纳米粒对BSA和BCS有一定量的吸附但处于较低的水平,具有较好的血液相容性。MTT检测结果显示,OCS纳米粒对胎鼠皮肤成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts, MEF)未表现出明显的细胞毒性。 以阿霉素(doxorubicin, DOX)为模型药物,对载药OCS纳米粒的药物包载和释放性能进行了检测。纳米粒的红外光谱和粒径分布检测证实OCS纳米粒对DOX的负载。载药OCS纳米粒(DOX-OCS纳米粒)呈球形,形态完整。对DOX-OCS纳米粒的载药量和载药率研究表明:不同取代度和分子量的OCS纳米粒的载药率均高于40%,且取代度越高,OCS纳米粒对DOX的载药率越高,载药量越大;分子量越高,OCS纳米粒对DOX的载药率越低,载药量也越小。对DOX-OCS纳米粒体外释药行为研究的结果表明:在pH 3.8的条件下,DOX在6h内释放完全;在pH 6.8的条件下,载药纳米粒对DOX在6h内突释然后缓释至72 h,具有较好的药物缓释效果。在pH 6.8的条件下,不同取代度和分子量的OCS纳米粒均表现出一定的药物缓释性能,且ocs取代度的提高和分子量的增大可以增强缓释效果。 空白OCS纳米粒、DOX-OCS纳米粒以及游离DOX对人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402以及人胃癌细胞SGC-7901四种肿瘤细胞体外生长的抑制实验结果表明,空白OCS纳米粒无显著细胞毒性:DOX-OCS纳米粒及游离DOX对四种肿瘤细胞的体外生长均表现出一定的抑制作用。随着纳米粒中负载的DOX浓度的增大和作用时间的延长,DOX-OCS纳米粒和游离DOX对肿瘤细胞生长的抑制率增大,但不同浓度DOX-OCS纳米粒对不同细胞的抑制效果有所不同。在药物浓度为0.05μg/mL至1μg/mL时,DOX-OCS纳米粒对四种肿瘤细胞表现出较游离DOX更高的生长抑制率;在药物浓度为5μg/mL至10μg/mL时,DOX-OCS纳米粒对A549和HeLa细胞表现出较游离DOX高的生长抑制率,而对于Bel-7402和SGC-7901细胞而言,DOX-OCS纳米粒的生长抑制率与游离DOX无显著差别。不同分子量DOX-OCS纳米粒对四种肿瘤细胞生长均表现出明显的浓度和时间依赖性的抑制作用,且随着OCS分子量的增大,DOX-OCS纳米粒对四种肿瘤细胞生长的抑制率下降。 对空白OCS纳米粒、DOX-OCS纳米粒以及游离DOX尾静脉注射后对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤效果进行检测的实验结果证明,DOX-OCS纳米粒可显著抑制S180荷瘤小鼠的实体瘤的生长,较游离DOX具有更强的抗肿瘤活性。此外,OCS纳米粒对DOX的负载减少了DOX对正常组织和器官的损伤,有效降低了药物的毒性。 以A549和RAW264.7为模型细胞对荧光标记OCS纳米粒(FITC-OCS纳米粒)的细胞摄取情况的研究结果表明, A549细胞和RAW264.7细胞对FITC-OCS纳米粒的摄取具有明显的时间和浓度依赖性,随着作用时间的增长和纳米粒浓度的增大细胞摄取量逐渐增加,且在实验选择的时间和浓度范围内细胞对纳米粒的摄取均未呈现饱和状态。当作用时间小于2h时,RAW264.7细胞对FITC-OCS-11%纳米粒的细胞摄取量高于A549细胞对纳米粒的摄取量;而作用时间超过2h时,A549细胞对纳米粒的摄取量高于RAW264.7细胞对纳米粒的摄取量,表明其用作抗肿瘤药物的缓释载体是可行的。此外,OCS取代度越高,A549细胞对纳米粒的摄取量越大。 以健康昆明小鼠为模型对FITC-OCS纳米粒的组织分布情况进行检测。实验结果表明,注射后1 d,FITC-OCS纳米粒在肝脏、脾脏和肺部的分布较少,在肾脏和血液中分布较多,随着作用时间的增长,FITC-OCS纳米粒在肝脏、脾脏和肺部的分布增加,在肾脏和血液中的含量降低。 综上所述,本研究证实了OCS纳米粒是一种生物相容性良好且具有一定缓释功能的纳米材料,载药纳米粒较游离药物具有更强的体内、体外抗肿瘤作用,适合于用作疏水性抗肿瘤药物的载体。


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