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哈维氏弧菌寡肽透性酶原核表达、突变株构建及其性质研究

何庆芳  
【摘要】:哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌,是发光弧菌的主要成员之一。在海洋环境及鱼、甲壳类和无脊椎动物等海洋动物中广泛存在。许多国家爆发的大规模性对虾死亡及中国和南亚一些国家报道的鱼的致病都跟哈维氏弧菌有关。 一些革兰氏阴性菌例如大肠杆菌有三套肽转运系统,以帮助它运输多种底物,满足其对氮源宽泛的需求。这三个系统为二肽透性酶(Dpp),三肽透性酶(Tpp)和寡肽透性酶(Opp)。寡肽转运系统属于ABC型转运家族全转运蛋白型,由5个亚基组成:1个胞外寡肽结合蛋白(oppA),它负责与进入细胞的底物特异性地结合,将其传输给转运蛋白(translocator);形成运输通道的2个跨膜蛋白(oppB/oppC);2个核酸结合区(oppD/oppE)。它是一个溶质结合蛋白,不仅为细菌生长提供碳源和氮源,还参与胞内信号传导。越来越多的证据显示ABC型转运蛋白与细菌的致病性相关。 从哈维氏弧菌SF-1基因组中用PCR扩增得到特异性片段,含寡肽结合蛋白基因,该基因全长1665 bp,编码554个氨基酸。以哈维氏弧菌SF-1基因组DNA为模板,将扩增的基因片段与克隆载体pMD-19T连接,构建重组质粒并测序,序列分析发现与创伤弧菌,副溶血弧菌,河弧菌等的寡肽结合蛋白具有很高的相似性;将目的片段与表达载体pET-28a(+)连接构建重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21;经IPTG诱导表达,用镍亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测发现破碎的菌体和上清中均表达出大小为58 kDa左右的目的蛋白。 纯化的重组寡肽结合蛋白具有磷脂酶C活性和溶血活性。蛋白磷脂酶C活性的最适温度为55摄氏度,当高于46摄氏度时,酶活力急剧下降。在66摄氏度时,磷脂酶的活力几乎全部丧失。酶的最适反应pH值为8.0,在pH为7.0时,酶活力比较稳定。将纯化的蛋白注射斑马鱼,导致鱼的死亡,鱼鳃部和腹部均有出血现象,表明该蛋白具有致病性。 扩增寡肽透性酶基因ORF 97-604区间507 bp的片段,连接克隆载体pMD-19T,并连接自杀质粒pNQ705,利用同源的方法构建寡肽透性酶基因突变株。野生株与突变株在正常培养条件下生长状况没有明显差异。运用Western blot检测发现突变株中寡肽透性酶的表达量远远低于野生株,野生株对斑马鱼半数致死量为3.11×10~4 CFU/尾,突变菌株的LD50为5.46×10~5 CFU/尾,表明突变株的毒性降低。


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