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海洋弧菌复苏促进因子家族糖蛋白酶的研究

赵明君  
【摘要】:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)广泛分布于江湖河口及海洋环境,是引起水产动物疾病的条件性致病菌,副溶血弧菌也是引起人食物中毒的重要病原菌。副溶血弧菌和哈维氏弧菌在不良环境形成活的非可培养(VBNC)状态,条件适宜时复苏为可培养形式,引起动物疾病,但有关细菌复苏的机制仍不清楚。藤黄微球菌细胞复苏促进因子(Resuscitation-promoting factor, Rpf)的发现是研究休眠菌复苏机制的一个重大突破,微量的Rpf能有效促进休眠微球菌的复苏以及生活状态细菌的增殖。有关弧菌细胞复苏促进因子家族蛋白的结构与功能研究报道较少,本文对副溶血弧菌和哈维氏弧菌的Rpf家族的糖蛋白酶(glycoprotease, Gcp)基因进行克隆、表达,并构建哈维氏弧菌gcp基因突变株,对表达Gcp生物学功能及突变株性质进行研究,为进一步探索海洋弧菌VBNC状态的形成和复苏机制奠定基础。 从副溶血弧菌、哈维氏弧菌基因组中克隆的gcp基因由702 bp组成,编码233个氨基酸残基的蛋白质,都不含有明显的信号肽和跨膜蛋白结构域。副溶血弧菌8621.4的Gcp与其他副溶血弧菌菌株、哈维氏弧菌、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌、费氏弧菌、杀鲑弧菌等的糖蛋白酶的氨基酸序列相似性为67%–100%,与变形杆菌和沙门氏菌复苏促进因子的相似性分别为55%和57%,与耶尔森氏菌的M22肽酶YeaZ的相似性为55%。哈维氏弧菌SF-1的Gcp序列与其他哈维氏弧菌菌株、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶珊瑚弧菌、霍乱弧菌、梅氏弧菌和灿烂弧菌等糖蛋白酶的氨基酸序列相似性分别为69%–98%,与大肠杆菌糖蛋白酶的序列相似性为58%–59%。 将副溶血弧菌8621.4和哈维氏弧菌SF-1的gcp基因克隆于原核表达载体,在大肠杆菌中表达,采用Ni亲和层析柱纯化的Gcp为单一的蛋白带。利用纯化的副溶血弧菌8621.4表达Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-blotting方法检测发现正常生长的副溶血弧菌8621.4和哈维氏弧菌SF-1胞内表达Gcp蛋白,在培养上清中检测不到表达的Gcp,分子量约为27 kDa,与已报道其他细菌的Rpf分子量相近;VBNC状态诱导过程中(低温寡营养)的副溶血弧菌8621.4和哈维氏弧菌SF-1菌体也能特异性表达该蛋白,而在VBNC状态的副溶血弧菌菌体中检测到2条特异表达蛋白带,其中一条蛋白的分子量约为27 kDa,另一条蛋白的分子量约为54 kDa,推测其为Gcp蛋白的二聚体。研究发现哈维氏弧菌SF-1表达的Gcp蛋白对正常生活状态下SF-1的促生长作用非常显著(OD590, p0.01),通过同源重组构建gcp基因突变株,发现正常生活状态的突变株MUTSF-1比野生株的生长能力强(OD590, p0.01),但添加Gcp蛋白的突变株和野生株的生长能力相当(OD590, p0.05),突变株MUTSF-1的毒力(LD50)比野生株降低。野生株和突变株LD50分别为2.66×104 CFU/ mL和3.13×105 CFU/ mL。


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