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哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究

辛瑞晓  
【摘要】:哈维氏弧菌是一种有运动性,短杆的革兰氏阴性海洋细菌,由于它有广泛的寄主范围,所以是日本对虾,海参和各种鱼类等海水养殖动物的重要病原弧菌。在中国(包括台湾)、泰国、印度、澳大利亚等国家和地区,均有由哈哈维氏弧菌引起水产养殖动物病害流行的报道,造成了水产养殖巨大的经济损失。抗生素在养殖病害的防治方面发挥了积极的作用,但是滥用抗生素造成的药物残留和细菌耐药性等不良后果,限制了其广泛应用。所以人们转向利用基因工程的方法研究包括DNA疫苗,活载体疫苗,基因工程亚单位疫苗等多种类型的新型疫苗,这些疫苗安全高效的优势,在鱼类病害防治方面具有很好的应用前景。 在正常代谢中细胞可以产生内源性的活性氧,而且在应答极端温度、紫外照射、强光、高渗、毒素等环境压力也会加速它的产生。当ROS的产生和ROS清除之间的平衡机制破坏,就会出现氧化应激并导致机体损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)通过催化超氧阴离子自由基(O2-)形成O2和H2O2,作为一种重要抗氧化酶,是生物体防御氧毒性的第一道防线。超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于各种生物体内,根据所含金属离子的不同,可以分为Cu,Zn-SOD、Mn-SOD,Fe-SOD。 本文通过同源引物从哈维氏弧菌SF-1基因组扩增得到了sod基因,将sod基因克隆至pMD-19T载体测序,并进行序列的生物信息学分析。sod基因全长600bp,含有完整的基因开放阅读框,编码199个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast比对,表明溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)40B、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) K5030的Fe-SOD的序列相似性高达98-99 %,与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)V52、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)CIP69.14、拟态弧菌(Vibrio mimicus)VM603等Fe-SOD的序列相似性分别为91-95 %。 将sod基因克隆于pET-26(+)表达载体,构建的阳性质粒在受体菌大肠杆菌BL21中进行表达,用1 mmol/L IPTG于25℃诱导6 h后,SOD得到了很好的表达。利用表达的融合蛋白N末端的6个组氨酸的多肽标签,通过镍亲和层析完成了SOD的分离纯化。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,纯化的蛋白为单一条带,分子量约为27 kDa。 采用邻苯三酚自氧化法对SOD酶活分析。酶的最适温度为20℃,最适pH为7,是一种对热敏感的低温酶,在10-30℃的温度范围内酶活力稳定,温度超过40℃时酶的活力明显丧失,60℃处理1 h后酶活力剩余为3 %。酶在pH 6-8时稳定。对纯化的SOD含有的金属离子类型进行鉴定:纯化的蛋白最大吸收峰位于280 nm和362 nm,具有典型的Fe-SOD吸收光谱;对氯仿-乙醇和H2O2敏感,表明该属于Fe-SOD。 纯化的重组SOD蛋白,通过肌肉注射的方式免疫大菱鲆,4周后用致病性哈维氏弧菌SF-1进行人工感染试验,对大菱鲆的免疫保护率为80.00 %,而对照组的死亡率是100%,表明具有免疫保护效应。Western blot分析中纯化蛋白与大菱鲆血清发生反应,在相应位置出现了特异性免疫反应条带,说明免疫大菱鲆的血清中可以检测到的特异抗体。


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