肝素质量控制及新型酶法制备低分子量肝素研究

【摘要】：肝素和硫酸乙酰肝素是由糖醛酸一(1—4)一D一氦基葡萄糖的重复二糖单元组成的线性多糖。组成肝素和硫酸乙酰肝素的二糖结构单元有N—硫酸基、O一硫酸基以及AL乙酰基等多种衍生结构，这些结构单元在糖链中的连接顺序千变万化，因而形成了极其复杂的糖链一级结构。肝素在1916年被发现并于1935年开始在临床上作为抗凝剂使用至今。肝素是仅次于胰岛素的使用最广泛的天然药物。我国是肝素原料药生产大国，产量占世界总产量的一半以上。2008年上半年在美国发生的肝素钠污染事件导致一百多八死亡，这个事故重新引起了人们对肝素结构研宄和质量控制的重视。 本论文分四个章节，分别从肝素的结构、肝素酶的性质、肝素酶对肝素的降解以及新型低分子量肝素的制备等四个方面来阐述肝素及肝素酶的特点和性质。肝素的结构非常复杂，目前还不能直接对肝素这样大的复杂多糖分子直接进行研宄。本课题通过将肝素降解成分子量从小到大的不同糖链长度的肝素寡糖的形式来研宄肝素的结构和序列，并讨论了肝素酶1在降解肝素时所表现的相关性质。 对于肝素酶的研宄已经很多。本论文在前八研宄的基础上，继续对肝素酶的选择性和降解的类型进行深入仔细地研宄。大部分的实验结果与已经报道的相同或者相近。研宄还发现，肝素酶1和肝素酶2显示出对底物相同的降解类型，均为底物依赖性的以外切方式为主的降解酶。除此以外，还发现了肝素酶3新的选择性降解的特点，即对某一种糖苷键的选择性降解跟糖苷键在糖链中的位置有关。 本论文的工作重点之一是应用三种肝素酶降解7种不同来源的药用肝素产品并用自制的肝素寡糖标准品对这些降解的肝素寡糖混合物进行定性和定量的研宄，比较了各个肝素样品之间在酶解以后的区别，定性定量地分析了肝素寡糖的成分。用酶法降解肝素并对寡糖进行成分分析的方法为肝素质量控制的新方法，可以用来检测肝素的结构和部分的序列。 以多种不同结构和分子链长度的肝素寡糖为底物，对肝素酶降解的选择性和水解类型进行了深入地研宄，发现肝素酶3不但可以部分降解肝素成低分子量肝素，而且不会破坏肝素分子中抗凝血活性所必须的五糖结构片段。采用肝素酶3制备出一种新型的低分子量肝素，并比较了其与已有的低分子量肝素的分子量和抗凝血活性。本论文的最后还简要地讨论了对肝素等这样复杂的多糖物质研宄的作用和意义，以及对肝素研宄的发展趋势的简单介绍。