噬菌体展示技术筛选藻毒素结合多肽、毒素调查及甲藻钙调蛋白基因的研究

【摘要】：近年来,随着全球范围内有毒藻华发生次数的增加,对人类危害程度的加剧,有毒赤潮已成为一个全球性的环境问题受到人们的普遍的关注。相关的研究如藻华与环境因素的关系、对生态系统的危害、藻毒素检测和藻种鉴定等方面都已取得了较多研究成果。分子生物学技术以其快速、简易及高灵敏度等特点,已经越来越多的被应用于藻毒素及藻种定性、定量的分析。另一方面,对赤潮藻生长增殖及对环境因子响应的分子机理的研究有利于更好的检测及预报赤潮的爆发,这方面的研究也逐渐受到人们的重视。本文利用噬菌体展示技术、酶联免疫方法(ELISA)和荧光定量PCR的方法,对水体中藻毒素,特别是微囊藻毒素的分子检测和赤潮藻生长增殖、应激的分子机理进行了研究。 (1)利用噬菌体展示随机十二肽库对微囊藻毒素进行亲和筛选。经过五轮筛选噬菌体克隆回收率从2×10-5增加到3.7×10~(-2),目标噬菌体克隆得到了有效富集。从第四轮和第五轮所筛选到的噬菌体克隆中随机挑取70个噬菌斑,使用酶联免疫法检测其单克隆的特异性,结果显示63个克隆为强阳性。挑取其中的10个克隆进行序列分析,结果显示多肽序列没有明显的一致性,但富含色氨酸小的基序在9个克隆中均出现,表明色氨酸可能是微囊藻毒素与蛋白质结合的位点;竞争性ELISA对筛选多肽和藻毒素的特异性和亲和力分析结果显示多肽可以特异性结合微囊藻毒素,然而亲和力要低于传统抗体和从抗体展示库的筛选的抗体片段。 (2)调查了夏季佛罗里达州中北部主要淡水生态系统中微囊藻毒素的分布,并通过相关性分析了其与叶绿素,溶解无机态营养盐,总氮,总磷,藻蓝蛋白等环境因子间的关系,进一步通过线性多元回归分析建立了微囊藻毒素浓度与环境因子的关系模型。34.1%的调查站位微囊藻毒素浓度超过了饮用水标准,表明微囊藻毒素已经对饮用水安全造成了较大的影响。74%的站位超过了赤潮叶绿素浓度10μg/L,表明淡水水华在佛罗里达州淡水生态系统较广泛存在。藻蓝蛋白(蓝藻特异蛋白)具有较高的浓度(平均浓度为370.5μg/L),说明在调查区域的水体系中蓝藻普遍存在着,且据有较高的浓度。相关性分析结果表明,不同水体系中的微囊藻毒素浓度与Chl-a, PC,PP, PN显著相关,与溶解态氮磷没有表现出显著相关,表明微囊藻毒素的浓度主要受控于浮游植物生物量。多元线性回归分析结果表明可以建立微囊藻毒素浓度与Chl-a, PC, PP, PN相关方程预测水体中的微囊藻毒素(r~2=0.36, p0.05)。 (3)克隆了赤潮藻链状亚历山大藻的钙调蛋白基因,并采用荧光定量PCR分析了在亚历山大藻生长时期及热激下基因的表达变化。共获得了597bp的钙调蛋白cDNA序列,包括25bp的5非翻译区,122bp的3非翻译区和450bp的开放阅读框,共编码149个氨基酸残基。编码的钙调蛋白氨基酸序列与其他物种的序列具有高度的同源性。采用荧光定量PCR,研究了钙调蛋白基因的表达量与链状亚历山大藻的整个生长周期的生长速率的关系。结果表明钙调蛋白的基因的表达量与生长速率具有相似的变化趋势,即前期表达量整体呈上升趋势,特别是在指数生长期的基因的相对表达量是平台期的表达量的8倍以上,而随着生长进入延滞期,生长速率及基因表达量都明显下降。另外发现了钙调蛋白在热激条件下,其表达量发生了明显的下调。实验结果说明了钙调蛋白在甲藻细胞增殖及对外界环境的响应方面具有重要作用。