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中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)基因组SNP标记的开发与应用

张建勇  
【摘要】:单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)被认为是很有应用前景的分子标记技术。本研究在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)转录组454高通量GS FLX系统大规模测序的基础上,依据预测的SNP位点设计引物,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR),对单核苷酸突变进行检测。利用开发的SNP标记,以F_1家系为作图群体,构建了中国对虾遗传连锁图谱并对相关生长性状体长和体重进行了QTL分析。本研究的主要结果如下: 1、完成了中国对虾转录组454高通量测序、contig的拼装和SNP位点的预测,该项在国家人类基因组南方研究中心帮助下完成。首先设计了80组ARMS-PCR引物,优化了四引物ARMS-PCR的扩增条件,为大规模引物设计筛选奠定了基础。其中有20组引物得到良好的分型效果。利用20组tetra-primer ARMS–PCR SNP引物对中国对虾6个家系共180个中国对虾个体基因组DNA进行扩增,均表现出多态性并分型成功。有效等位基因数分布范围1.127~1.993,平均1.600。期望杂合度和观测杂合度分布范围分别为0.505~0.609和0.373~0.487,多态信息含量分析显示20个位点的PIC值范围为0.145~0.373,低于标准值0.5,对于一个只有两个等位片段的标记或基因来说,多态信息含量较高,可以作为分子标记。通过哈迪-温博格平衡检验,结果显示只有8个群体位点明显偏离(P0.05),93.3%群体位点符合哈迪-温博格平衡。表明四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应是SNP基因分型的一种可行方法,可在中国对虾SNP遗传图谱构建、重要性状QTL定位以及分子标记辅助育种等研究中应用。 2、构建了中国对虾父母本的遗传连锁图谱。共设计了800组tetra-primerARMS-PCR引物,能扩增出目的产物的引物中,经过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,最终筛选出能扩增出不同基因型PCR产物的tetra-primerARMS-PCR引物310组。对作图群体的筛选表明,310组引物中符合中国对虾遗传连锁图谱构建的tetra-primerARMS-PCR引物200组。其中母本标记为119组,父本标记为115组。分别构建了中国对虾父母本的遗传连锁图谱,覆盖率分别为51.94%和53.77%。整合后的中国对虾连锁图谱包含16个连锁群,每个连锁群标记数6~24,共有180个标记,平均每个连锁群上有11.5个。连锁群长度范围36.3~106.8cM,图谱总长度是899.3cM,图谱平均间隔是5.2cM。 对180个SNP标记在作图群体中的分型结果进行分析,有效等位基因数分布范围1.041~1.993,期望杂合度和观测杂合度分布范围分别为0.067~0.772和0.169~0.657,最小等位基因频率分布范围为0.021~0.492,多态信息含量分布范围为0.145~0.481,通过哈迪-温博格平衡检验,显示171个位点(95%)符合哈迪-温博格平衡。 3、中国对虾家系体长、体重性状的测量值都显示出连续变异的特点,显示这些与生长相关的性状都是典型的数量性状或者多基因遗传。利用所构建的家系进行相关性状的QTL定位,在图谱中仅初步定位了1个与体重性状相关的QTL区间,分布在LG16连锁群上。利用最小二乘法对标记座位与中国对虾体重、体长性状进行连锁显著性检验,在180个SNP座位中,与体重显著相关的SNP位点有2个,分别是C2904-168和C12871-235。 在中国对虾转录组454高通量测序GS FLX系统大规模测序的基础上,依据预测的SNP位点设计引物,通过四引物扩增受阻突变体系PCR技术(Tetra-primer ARMS-PCR)进行SNP位点多态性的验证,建立简便快捷的中国对虾SNP分型方法。验证了SNP分子标记构建中国对虾遗传连锁图谱的可行性,并构建了包含一定数目SNP分子标记的遗传连锁图谱。为中国对虾重要经济性状的QTL定位,早期鉴定具有优良性状的个体,筛选优良亲本,从而加快育种进程,缩短育种周期,进行分子标记辅助育种奠定基础。


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