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肝脏特异性基因在文昌鱼中的鉴定及表达:肝脏和急相反应起源探索

王源  
【摘要】:肝脏是脊椎动物所特有的器官,有食物消化、血浆蛋白合成、激素生成和解毒等功能。肝脏还是参与急相反应(APR)的主要器官。肝脏的起源一直以来都是未解之谜;另外,脊椎动物样急相反应在动物演化中究竟启始于何时,也不清楚。文昌鱼是最接近于脊椎动物的原始脊索动物之一,是研究脊椎动物进化和起源的重要模式生物,文昌鱼的肝盲囊被认为是脊椎动物肝脏的同源器官。本文以斑马鱼129条肝脏特异性基因为模板,在文昌鱼中鉴定得到了58条同源基因,这些基因编码多种与生理生化功能相关的活性蛋白,如合成和代谢相关酶类、血液组分、转录因子和载体蛋白等。随后,应用实时定量PCR技术研究了这58条肝脏/肝盲囊特异性基因的表达情况,发现在LPS诱导的急相反应中共有52条同源基因具有相似的表达模式。肝细胞核因子(HNF)是调节脊椎动物肝脏特异性基因表达的重要转录因子,如HNF-4. CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)和信号转导与转录激活因子(STATs)都是脊椎动物肝细胞急相反应的重要调控因子。接下来,我们搜索比对HNF (HNF-1 HNF-3、HNF-4和HNF-6)和APR相关(HNF-4、C/EBP和STATs)转录因子在肝脏/肝盲囊同源基因启动子区的结合位点,发现在文昌鱼和斑马鱼中存在着相似的HNF和APR相关的转录调控网络,调控这些肝盲囊/肝脏特异性基因或急相反应相关基因的转录表达。由此可见,文昌鱼和斑马鱼共有大量的肝盲囊/肝脏特异性表达基因,其中的大部分基因在LPS诱导的急相反应中也具有相似的表达模式,并且在这些同源基因中还存在着相似的HNF与APR相关转录因子的调控网络。这些结果为证明文昌鱼肝盲囊是脊椎动物肝脏的同源器官提供了重要的支持,同时还说明,文昌鱼肝盲囊也是一个重要的免疫器官,且在脊椎动物肝脏出现之前的急相反应中起到了非常重要的作用,为研究脊椎动物肝细胞急相反应的起源和进化提供了新的思路。 血红细胞4.1蛋白是形成和维持血红细胞结构的主要蛋白,它能与细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白和各种转运蛋白相互作用并形成功能复合体,在维持和调节血红细胞正常的生理结构与功能起着重要作用。在文昌鱼中已经发现了粒细胞和巨噬细胞的存在,但一直没有发现可以自由循环的血细胞。因此,我们试图并成功地文昌鱼中克隆得到了具有完整编码框的4.1蛋白的基因(BbP41),对其结构、表达及进化进行了分析研究。BbP41基因包括一个1590 bp的最大开放阅读框,编码529个氨基酸,推测其蛋白分子量为59.3kDa。同源比对发现,BbP41蛋白与其他物种4.1蛋白的序列相似性高达47.0%-60.8%。文昌鱼BbP41蛋白也有保守的FERM、FA和CTD结构域,但缺少了SABD结构域。进化分析发现,BbP41蛋白位于脊椎动物分枝的基部,但不与脊椎动物4.1蛋白的各亚型聚群,说明BbP41与脊椎动物4.1蛋白同源,而且可能代表脊椎动物4.1蛋白的原始存在类型。BbP41基因组DNA序列分析发现其具有13个外显子和12个内含子,脊椎动物4.1蛋白家族明显具有更复杂的基因组结构。通过实时定量PCR检测发现,BbP4l基因在文昌鱼的脊索、卵巢、精巢、后肠和鳃中都有较高的表达量。构建原核表达载体并成功分离纯化了His-BbP41重组蛋白,获得了分子量约为66 kDa的融合蛋白,使用人类4.1R多克隆抗体进行Western杂交实验,结果表明融合蛋白的表达正确,能与人4.1R抗体特异性结合,说明BbP41蛋白与人类4.1R蛋白具有较高的同源性。通过ELISA和His-Pull Down实验说明,His-BbP41融合蛋白可以与肌动蛋白和血影蛋白相结合。


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