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迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的多样性分析及其鞭毛蛋白的功能研究

贺扬  
【摘要】:迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是目前水产养殖业中具有极大危害的革兰氏阴性病原菌。其宿主范围广,从鱼类、两栖类、爬行类直到哺乳类都有该菌感染的病例报道;更为重要的是,Edw. tarda除了给水产养殖造成巨大损失外,还是一种重要的人畜共患病病原菌,也是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员,对人类的健康造成了威胁。目前对于Edw. tarda的致病机理尚不明确,而且还未建立起针对Edw. tarda的商业化预防及治疗措施。为了保障养殖业能够健康、持续、稳定的发展,开展该病原菌致病机理的研究日显迫切。 鞭毛作为细菌的运动器官,也是重要的毒力决定因子,参与了一系列的致病过程;鞭毛蛋白作为细菌鞭毛的重要组分,在病原菌的致病过程中往往发挥重要的作用。但有关鞭毛蛋白在细菌致病过程中的具体作用和功能尚未得到明确证实。 本论文考察了不同来源的Edw. tarda在鞭毛、鞭毛蛋白编码基因(fliC)、运动性等方面的差异。为确定Edw. tarda鞭毛蛋白在参与细菌致病过程中的作用,本研究利用基因缺失突变技术(In-frame deletion mutation),分别对该菌中存在的两个鞭毛蛋白基因(fliC1和fliC2)构建了缺失突变株,并对致病相关的表型性状改变进行了比较分析,探讨了鞭毛蛋白基因在细菌致病过程中的作用,为该菌致病机理的研究及疫苗开发奠定了基础。 主要研究结果如下: 1.本论文全面考察了10株不同地区及宿主来源的Edw. tarda的多样性及差异,包括鞭毛形成、鞭毛蛋白编码基因(fliC)、运动性、生物膜形成能力、胞外蛋白、质粒、药物敏感性方面的差异。结果显示Edw. tarda存在明显的种内多样性,并表现出明显的地域性差异;发现菌体之间的鞭毛着生数量有所差异,且鞭毛着生的数量与细菌的运动性、生物膜形成能力之间存在正相关,即鞭毛着生数目多的菌株其运动性、生物膜形成能力也强,反之亦然;通过对Edw. tarda的fliC序列测定及与菌株EIB202基因组的鞭毛蛋白基因进行比对,发现Edw. tarda中存在两种鞭毛蛋白基因:fliC1和fliC2,二者的核苷酸相似性为86%,预测的氨基酸序列相似性为83%。鞭毛蛋白FliC氨基酸序列的比对分析结果显示,构成鞭毛骨架结构的FliC N-端和C-端序列,在不同Edw. tarda菌株中是非常保守的,而暴露在鞭毛表面的中间序列则相似性较低,这就决定了鞭毛表面抗原的多样性;Edw. tarda的胞外蛋白也具有致病相关特征,其中55kD、21kD和18kD的胞外蛋白与致病性密切相关;质粒图谱与细菌耐药性都存在明显的地域性差异。不同来源菌株的这些特性,表明Edw. tarda不同菌株可能具有不同的致病机理。 2.以Edw. tarda H1为实验菌株,pRE112为自杀质粒,pACYC184为互补质粒,构建了鞭毛蛋白基因fliC1的框内缺失突变株(ΔfliC1)及其互补菌株(fliC1~+),考察了突变株在鞭毛形成、运动性、生长情况、自凝作用、生物膜形成、胞外蛋白图谱、细菌耐药性及对模式动物致病性的影响。结果发现突变株ΔfliC1依然能够产生鞭毛,但鞭毛变细,导致细菌运动性、生长速度及生物总量、生物膜形成、自凝能力都受到抑制,且对头孢类及氨基糖甙类抗生素的耐药性发生转变;55 kD、21 kD和18 kD的胞外蛋白的分泌明显受阻,经蛋白质N-末端测序得知,这55 kD和21 kD的胞外蛋白均为Ⅲ型分泌系统效应蛋白,18 kD的胞外蛋白为Ⅵ型分泌系统效应蛋白。突变株ΔfliC1对斑马鱼的致病性也明显减弱。所产生的突变性状在互补菌株fliC1~+中几乎都得以恢复,证明了突变性状是由fliC1基因突变所产生。由此推测fliC1作为主要的鞭毛蛋白(Flagellin domain protein)基因,通过参与细菌的鞭毛合成,在Edw. tarda的生长、运动性、自凝作用、生物膜形成、Ⅲ型分泌系统效应蛋白及Ⅵ型分泌系统效应蛋白的分泌等过程中都发挥了重要作用,从而直接影响Edw. tarda致病性的产生。另外,突变株ΔfliC1在耐药性上发生的变化可能与外膜蛋白和脂多糖的结构变化有关。 3.以基因缺失突变技术构建了Edw. tarda H1鞭毛蛋白基因fliC2的框内缺失突变株(ΔfliC2)及其互补菌株(fliC2~+),并考察了相应的突变性状。结果发现突变株ΔfliC2依然能够产生鞭毛,且在鞭毛粗细上没有明显变化;细菌运动性、生长速度及生物总量、生物膜形成能力都受到轻微的抑制,且对β-内酰胺类抗生素的耐药性发生转变;胞外蛋白的分泌及细菌的自凝作用未发生改变;突变株ΔfliC2对斑马鱼的致病性也没有显著变化。所产生的突变性状在互补菌株fliC2~+中几乎都得以恢复,证明了突变性状是由fliC2基因突变所产生。由此推测fliC2作为鞭毛蛋白相关蛋白(Flagellin associated protein)基因,并未参与鞭毛合成,在Edw. tarda的生长、运动性、生物膜形成等过程中发挥一定的作用,对细菌的自凝、胞外蛋白的分泌及致病性的产生未见明显作用。


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