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刺参(Apostichopus japonicus)热休克蛋白基因克隆及其对温度、盐度胁迫的响应

于姗姗  
【摘要】:本文详细综述了OCLTT理论的研究进展,并通过实验研究了温度和盐度变化对热休克蛋白70、90表达的影响。研究结果总结如下: 1.刺参(Apostichopus japonicus)热休克蛋白70和90基因克隆及序列分析 本研究以刺参Apostichopus japonicus为实验对象,利用同源克隆技术和RACE技术获得了热休克蛋白70(GenBank Accession no:EU930813)和90(GenBank Accessionno:JF907619)基因,它们cDNA长度分别为2176和2293bp,开放阅读框长度为1950和2184bp,分别编码649和727个氨基酸的多肽分子。推导的氨基酸序列存在热休克蛋白70和90家族的签名序列,与已知其他物种的热休克蛋白70和90的氨基酸序列具有较高的同源性(热休克蛋白70,72-76%;热休克蛋白90,76-81%)。热休克蛋白70和90基因的克隆,对深入研究刺参对于环境胁迫的生理响应机制具有重要意义。 2.盐度骤变对刺参(Apostichopus japonicus)hsp70及hsp90基因表达的影响 为研究夏季暴雨导致的养殖池塘盐度变化对刺参(Apostichopus japonicus)生理的影响,本研究在实验室内模拟野外盐度变化,采用半定量RT-PCR的方法研究了其hsp70、hsp90a及hsp90b基因表达。在本实验中,盐度先以每6h降2.5的速度由30降至20;保持96h后,再以同样的速度由20升至30,随后在盐度为30条件下保持96h。在盐度变化过程中随机取样。hsp70和hsp90b基因在盐度降至20后表达量开始显著升高(P 0.05),hsp90a基因在盐度降至22.5时表达量开始显著升高(P 0.05);但保持在盐度为20条件下,3个基因的表达量均逐渐降低至初始值。在之后盐度升高及恢复阶段,3个基因表达量均有先升高后降低的趋势,表明hsp70、hsp90a和hsp90b基因是刺参在盐度胁迫下的重要响应因子。 3.变温模式下刺参耗氧率及hsp70、hsp90基因表达量的变化 生物对温度变化的生理反应可以反映出生物个体对其生存环境的进化适应及其对热胁迫的耐受能力。为了研究潮间带生物对热胁迫的生理适应,本实验测定了刺参在热胁迫下的耗氧率及热休克蛋白基因表达量。模拟自然环境温度变化,研究刺参温度、生理反应(耗氧率和热休克蛋白)以及热耐受之间的关系。当温度由24℃升至30℃,刺参耗氧率下降、热休克蛋白基因(hsps)表达量上升。当水温超过30℃,刺参出现大规模死亡,表明上调表达的热休克蛋白以及死亡率都与有氧代谢的下降关系紧密,这一现象与氧气与能力限制的热耐受性理论(OCLTT)相一致。刺参的这种生理上的热耐受性反映了其对自身生存环境的一种适应能力。


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