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四溴双酚A(TBBPA)对栉孔扇贝毒性效应与差异基因筛选的研究

宫晓莉  
【摘要】:为了防止火灾的发生,溴系阻燃剂(Brominated flame retardants)被广泛的应用于塑料、电子产品等中去。最广泛应用的溴系阻燃剂包括多溴联苯醚(polybrominated diphenyl esters)、六溴环十二烷(hexabromocyclodecane)和四溴双酚A(tetrabisphenol A),其中四溴双酚A是市场上应用最广泛的溴系阻燃剂,由于它的生物累积性以及迁移性对环境造成了持久的危害。据报道TBBPA在各种环境介质中普遍存在,比如水,空气,土壤甚至人体中。TBBPA对水生生物具有很高的急性毒性效应,但关于TBBPA对水生生物的亚慢性毒性效应的研究很少,分子和基因表达分析的研究更是少之又少。栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国沿海重要的养殖贝类,本文以栉孔扇贝作为研究对象,分别从酶学水平和分子水平研究了TBBPA对栉孔扇贝的毒性效应,并运用抑制消减杂交技术筛选出栉孔扇贝在TBBPA胁迫下的差异表达基因,为后续基因芯片的研究提供了理论基础。 1四溴双酚A对栉孔扇贝毒性效应的研究 本文研究了TBBPA对栉孔扇贝(Chlamys farreri)的毒性作用,实验选取栉孔扇贝幼贝、成贝壳高分别为(1.0±0.15) cm、(4.6±0.2)cm。设置栉孔扇贝幼贝、成贝急性毒性实验梯度:2、2.8、3.92、5.488、7.6832mg/L和1、1.4、1.96、2.744、3.8146mg/L(间隔系数为1.4),栉孔扇贝成贝亚慢性毒性实验梯度:50、100和200μg/L,且均以自然海水作为对照组。结果显示:栉孔扇贝幼贝和成贝在24h、48h、72h、96h的LC_(50)分别为5.924、4.169、3.095、2.614mg/L和2.458、1.657、1.502、1.342mg/L。TBBPA对栉孔扇贝组织AHH、GST、SOD活力和DNA损伤(F值表示)影响显著(P0.05),而对照组无明显变化。两组织各处理组AHH、SOD活力均被显著抑制,且在实验时间内呈峰值变化,稳定后皆显著低于对照组水平(P0.05);两组织各处理组GST活力在50μg/L处理组被显著诱导而在100、200μg/L处理组均被显著抑制,且分别在9d、6d内呈峰值变化,稳定后显著高于或低于对照组水平(P0.05);鳃组织中50μg/L处理组F值在3d内呈峰值变化,于1d达到最大值,并于3d恢复至对照组水平(P>0.05);100、200μg/L处理组F值在9d内成峰值变化,并分别于3d、1d达到最小值,并于9d后恢复至对照组水平(P>0.05)。消化盲囊组织中各处理组F值在15d内呈峰值变化,并均于6d达到最大值,15d后恢复至对照组水平(P>0.05)。由此可见,栉孔扇贝在TBBPA胁迫下急性毒性效应明显,组织解毒代谢酶活力表现出明显的时间、剂量效应性,鳃丝、消化盲囊AHH、GST和SOD活力可作为栉孔扇贝TBBPA污染评价的潜在生物标志物。 2栉孔扇贝芳烃受体转运蛋白(ARNT)基因的克隆与序列分析 本研究通过相近物种的ARNT氨基酸序列比对,设计兼并引物钓取核心片段及运用Race法扩全长。结果得到栉孔扇贝ARNT序列1268bp,包括1020bp的ORF,起始密码子ATG,终止密码子TAG,该序列共编码340个氨基酸,等电点(pI)为7.868,分子量37.70845kDa。将栉孔扇贝的氨基酸序列通过多重序列比对后发现与其他物种有较好的保守性,同源性较高。组织特异性分析ARNT基因在鳃、消化盲囊、闭壳肌、足和外套膜中均有分布,其中鳃组织中的表达量相对最高,而在外套膜表达量相对最低。 3栉孔扇贝在TBBPA胁迫下基因表达分析的研究 本研究运用抑制消减杂交技术筛选TBBPA胁迫下的差异基因。正反向共测序316个克隆,除去序列较短以及测序失败的样品,共得到247个EST序列,其中正向消减文库203个,反向消减文库44个,文库中EST序列与已知基因的匹配率达到78.16%。运用Blast2go软件对序列进行分类,反向文库包括:细胞分化(2%),细胞过程(31%),死亡(5%),代谢过程(32%),生物周期(9%),定位(7%),应激(14%);正向文库包括:细胞过程(23%),免疫过程(1%),死亡(5%),应激(3%),细胞组成(3%),新陈代谢(19%),细胞凋亡(1%),发育过程(5%),生命周期(10%),繁殖(1%),细胞组成(5%),多细胞机体过程(1%),定位(13%),信号转导(2%)。GenBank序列号为JK729464–JK729642。运用荧光定量技术对差异基因进行验证并进一步对部分基因进行表达分析,结果显示栉孔扇贝在TBBPA胁迫下鳃组织反向文库中的基因表达与对照组相比显著降低(P﹤0.05),而正向文库中的基因表达与对照组相比显著升高(P﹤0.05);栉孔扇贝鳃组织在TBBPA胁迫下所选基因被显著诱导(P﹤0.05),而对照组无显著变化。各处理组各个基因均在1d后被显著诱导升高,然后或逐渐降低趋于稳定,或继续升高,稳定后,各处理组基因与TBBPA的污染浓度呈现一定的相关性。


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