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雨生红球藻细胞转化及虾青素的提取

张睿钦  
【摘要】:虾青素具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力,可有效防止组织、细胞和DNA的氧化损伤,具有广泛的应用。雨生红球藻是目前公认的虾青素的最好生物来源。雨生红球藻具有明显的生命周期,通过环境胁迫藻细胞由绿色游动细胞转化为厚壁孢子并大量积累虾青素。本文以实验室保藏的一株雨生红球藻为藻种,以虾青素含量为指标,首先通过中心组合实验(CCD),对转化阶段的培养基进行优化,然后将优化后的乙酸钠培养基中的虾青素含量与葡萄糖培养基中虾青素含量进行对比,发现添加葡萄糖的培养基虾青素含量更高,因此选择葡萄糖培养基作为最优培养基,成分为:葡萄糖:3g/L,KNO_3:0.3g/L,KH_2PO_4:0.03g/L,MgSO_4:0.1g/L,CaCl_2:0.08g/L,Fe-EDTA:100μl/L,微量元素:100μl/L,虾青素含量为16.98±0.68mg/L,比乙酸钠最优转化培养基中的虾青素含量高53.67%。而后,通过Box-Behnken对转化条件进行优化,得到最优转化条件为:转化温度29.92℃,转化光照7203.95lx,转化时间10.6d,pH10,虾青素含量达33.80±1.56mg·L~(-1),是未优化转化条件时的1.99倍。最后,对装液量和转化时间对虾青素含量的交互影响进行了研究,发现:减少装液量,增大藻液的相对表面积,可有效提高转化效率,缩短转化时间,提高虾青素含量。在装液量49.49ml,转化时间为10.36d时,虾青素含量达36.91mg/L,比100ml装液量情况下转化得到的虾青素含量高10%左右。 完成上述实验后,针对红光对雨生红球藻生长的影响和蓝光对于转化的影响进行了探讨。研究发现:生长最适光照为:白光为主,红光为辅,白光:红光(2:1)2500lx,所得藻干重为0.72±0.03g/L,比白光照射情况下高6.3%。最适转化光照为:蓝光(2000lx)+白光(6000-7000lx),虾青素含量达38.44±1.64mg/L,比白光转化情况下高14.9%左右,且加入蓝光后,藻细胞变红的时间明显缩短,转化9d即可得最高虾青素含量,比白光照射情况下约提前1.6d,可见蓝光对虾青素积累的促进作用较强,应用于生产上可有效节约成本。若进一步提高蓝光比例可能会有更好的效果。 为了找到合适的保种方法,对继代保藏、固定化保藏和低温保藏三种常见的藻种保藏方法进行了研究,发现低浓度(5%)液体保藏简便易行效果较好,保藏4个月后存活率和相对生长速率常数分别为93.84±3.88%和0.4648±0.0021d~(-1)),适宜在科研实践中使用;固定化保藏储存方便,保藏4个月后存活率和相对生长速率常数分别为:30.51±1.33%和0.26±0.01d~(-1)),此方法随保藏时间延长藻细胞死亡速率减慢,适合长期保藏;10%DMSO做保护剂,-20℃低温保藏时,存活率和相对生长速率常数分别为42.27±1.88%和0.1550±0.0063d~(-1)),20%DMSO做保护剂-40℃保藏时存活率和相对生长速率常数分别为49.05±2.03%和0.1750±0.0065d~(-1)),此种方法不易染菌、藻细胞性状稳定。 通过对雨生红球藻中虾青素提取的初步研究,得到最佳破壁条件为:高速分散均质机频率50Hz,23000rpm,破壁6min;其破壁率达96±3.94%左右,破壁率高,处理量较大,适用于生产。对用于虾青素提取的有机溶剂进行了筛选,得出DMSO和丙酮(4:1)混合时虾青素提取率最高,可达34.04±1.53mg/L,比DMSO提取时高4.4%。对于得到的虾青素粗品的纯化方法还需进一步研究。


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