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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)性别决定的基因组学研究

邵长伟  
【摘要】:半滑舌鳎是我国沿海特有的重要经济鱼类。由于其雌雄生长差异巨大,雄性个体生长速度过慢加大了养殖成本,严重阻碍了半滑舌鳎养殖产业的规模化推广。因此,解决半滑舌鳎雌雄比例问题,实现全雌化养殖对于半滑舌鳎产业化发展具有重要意义。此外,半滑舌鳎性别决定系统为ZZ/ZW型,具有异型性染色体,并且发现存在天然性逆转现象。因此,半滑舌鳎也是研究鱼类性别决定和分化的理想模型。本文围绕半滑舌鳎的性别决定和分化,从大片段基因组文库构建及性别基因筛选、高密度遗传连锁图谱绘制及性别连锁分析以及性逆转的表观基因组等基因组学研究的不同层面,初步分析了半滑舌鳎性别决定和分化的基因组学特点,为半滑舌鳎性别决定机制的解析奠定了基础。其主要结果如下: 1.以pECBAC1为载体,用BamHI和HindIII内切酶构建了2个高质量的半滑舌鳎BAC文库。2个BAC文库共由55,296个克隆组成,空载率小于3.2%,平均插入片段约为156.4kb,两个文库的覆盖率约为半滑舌鳎单倍体基因组大小的13.36倍。根据半滑舌鳎AFLP雌性特异标记和性别相关基因设计Overgo探针,进行同位素原位杂交,获得228个阳性克隆,其中性别相关基因获得阳性克隆76个,平均每个基因阳性克隆为15.2个,和BAC基因组覆盖度基本一致;雌性特异标记获得阳性克隆152个,平均每个标记获得阳性克隆30个,为半滑舌鳎BAC基因组覆盖度2倍多。利用ABI3730常规测序获得含有性别相关基因(Sox9、Dmrt1和Cyp19a1a)和雌性特异标记(CseF382)的5个BAC阳性克隆全长序列,长度分别为127kb(Sox9),145kb (Dmrt1),165kb (Dmrt1),107kb(Cyp19a1a)和135kb (CseF382)。分析了含有Cyp19a1a基因BAC全长序列的结构特点(重复序列、GC含量、转座元件等),从BAC序列预测了9个基因,其中7个为已知基因。利用青鳉、斑马鱼、三棘刺鱼、红鳍东方鲀和黑青斑河豚的基因组序列开展了Cyp19a1a基因的比较分析,发现该基因在不同鱼类具有结构和功能的保守性,主要包括所有鱼类的Cyp19a1a基因都具有9个外显子和8个内含子;均含有5个保守的功能域;上游调控元件的保守性以及卵巢高表达的特异性等。 2.利用基于新一代测序技术的RAD-Seq构建了半滑舌鳎高密度SNP遗传连锁图谱,并开展了全基因组性别连锁分析。首先利用HiSeq2000对半滑舌鳎父母本进行了全基因组重测序,获得reads数目分别为113M和101M,测序深度分别达到16.8×和15.1×,基因组覆盖率达到92.8%和94.9%。经过严格的筛选条件,获得父本杂合位点(1:1),母本杂合位点(1:1)以及双亲杂合位点(1:2:1)SNP数目分别为407,084个,397,300个和89,989个,覆盖scaffolds的数目分别为3,553个,3,509个和1,925个,总长度分别为452Mb,453Mb和448Mb,基因组覆盖度达到96.2%,96.4%和95.3%。利用pst1酶切对F1代216个个体进行了RAD-Seq,测序深度为0.4×,reads数目从2,275,870个-11,639,889个,平均为6,224,947个。经过筛选获得RAD-tag数目从699,271个-1,134,343个,平均为913,371个。对F1群体基因分型的结果进行分离比检验(P=0.05),总共得到满足分离比的13,116标记,其中母本杂合的标记为5,610,覆盖scaffolds数目为1,018个,总长为396Mb。父本杂合的标记为6,428,覆盖scaffolds数目为1,031,总长为402Mb。双亲杂合的1:1位点标记为1,078,覆盖scaffolds数目为636个,总长为304Mb。利用Joinmap3.0软件从满足分离比的13,116个标记均匀选取3,528个标记,初步构建了半滑舌鳎高密度SNP遗传连锁图谱,包含22个连锁群,其中常染色体连锁群20个,性染色体连锁群2个。平均每个连锁群含有遗传标记160个,总图距为1999.535cM,平均间距为0.568cM/marker。标记覆盖的scaffolds的总长为422Mb,约占基因组大小的88.4%。利用高密度SNP遗传连锁图谱开展了性别的全基因组连锁分析,发现其他染色体上的LOD值均在2.5以下,而W染色体上所有的标记LOD值均显著大于2.5,加性效应均为负值,表明W染色体上等位基因与半滑舌鳎性别决定具有显著关联性。 3.利用全基因组甲基化测序(WGBS)绘制了半滑舌鳎单碱基分辨率的全基因组甲基化图谱,初步揭示了半滑舌鳎性逆转的表观遗传机制。利用IlluminaHiSeq2000完成了半滑舌鳎正常雌鱼、正常雄鱼和伪雄鱼性腺的WGBS,获得有效数据16.81Gb,21.15Gb和18.63Gb,单链的覆盖深度分别达到19.65×,25.39×和21.60×,mCs约占基因组中所有胞嘧啶的8.67%、8.86%和8.76%。97%以上的甲基化位点都发生在CpG区域,并且绝大多数mCs都具有较高的甲基化水平。半滑舌鳎基因TSS两侧区域具有较低的甲基化水平,而在基因编码区、内含子以及3’UTR区域均具有较高的甲基化水平。所有的转座元件(DNA、LINE、SINE、LTR等)均呈现出与基因组相似的甲基化水平,而简单重复序列(Simple Repeat)和随机重复序列(Tandom Repeat)则呈现出较低的甲基化水平。此外,在各种小RNA区域,则表现出不同的甲基化水平,在snRNA的下游区域具有较高的甲基化水平,在rRNA和tRNA区域甲基化水平相对基因组整体较低,而在miRNA区域则表现出与基因组甲基化类似的水平。根据mCs所在的位置,将半滑舌鳎基因分为甲基化基因和非甲基化基因,在正常雌鱼、正常雄鱼和伪雄鱼中,甲基化的基因为20,237个、20,183个和20,199个,占所有基因的97.03%,96.77%和96.85%,非甲基化的基因仅为619个、673个和657个。伪雄鱼和正常雄鱼基因组甲基化水平整体较为相似,均具有较高的甲基化水平,而与正常雌鱼的差异显著。正常雌鱼和正常雄鱼的DMRs达到了14.87Mb,正常雌鱼和伪雄鱼的DMRs为11.16Mb,而正常雄鱼和伪雄鱼的DMRs仅为0.25Mb。从差异甲基化基因中,筛选到多个与性别相关的基因如Cyp19a1a、 Sox9a、Foxl2、Gsdf等。


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