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壳聚糖微球制备优化及其乙酰化微球作为潜在栓塞材料的研究

周旋  
【摘要】:经导管血管栓塞术(Transcatheter arterial embolization, TAE)是在X射线透视下,经导管向靶血管内注入或送入栓塞物质,使血管闭塞从而达到预期治疗目的的技术。它通过阻塞血管血流,减少病灶或身体某个特定部位的血液供给达到治疗疾病目的。该技术具有微创性、全程影像引导和选择性靶血管插管技术,使得栓塞的准确性和可控性大大增强,成为革命性的临床治疗方法。微球因其栓塞效果好、对特定组织器官的靶向性高、可以与化疗药结合可缓释药物等优点,从而受到越来越多的关注,是目前常见的栓塞载体。 壳聚糖(Chitosan)是甲壳质脱乙酰基后得到的一种天然阳离子多糖,化学名称为β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。具有良好的生物相容性、生物可降解性、天然无毒、抑菌性、抗肿瘤、增强免疫及抗氧化活性等,在医药、食品、农业、生化、化工、环保等诸多领域都有一定的应用价值。近年来以壳聚糖及其衍生物为原料的有关栓塞剂一直是研究的热点,其既具有自身优良的生物学活性,又可以包载多种药物,起到物理栓塞和化学治疗双重作用。本文以壳聚糖为原料,采用乳化-交联法制备壳聚糖微球(CMs)及乙酰化微球(ACMs),检测其理化性质及生物相容性,利用乙酰化后的微球进行兔耳模拟栓塞实验检测栓塞效果,为临床应用奠定基础。 采用O/W乳化交联法对现有的壳聚糖制备微球,通过单因素分析法和响应面分析法综合考察了壳聚糖浓度、乙酸浓度、Span80量、甲苯量、乳化转速、乳化时间、甲醛量和交联时间对微球制备的影响,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验及Box-Behnken实验设计分析各因素的主次效应、优化各因素水平,多次实验后得出微球制备工艺为:2%(w/v)壳聚糖用1.7%(v/v)的醋酸溶解,取100ml加入含7ml Span80和2ml tween-60的488ml甲苯中,1100rpm搅拌60min充分乳化,然后加入10ml甲醛溶液再搅拌60min进行固定,最后完成微球的制备。经重复实验得到微球实验值(8.03g)和理论值(7.93g)相差不大,所得微球表面光滑、球形完整、形状规则。 经乙酰化CMs得到乙酰化壳聚糖微球(ACMs),微球表面光滑、球形完整,分散良好。FT-IR显示ACMs在1595cm~(-1)处出现乙酰氨基特征吸收峰。壳聚糖、CMs、ACMs的脱乙酰度分别为90.57%、84.83%和20.92%,说明形成微球后有5.7%的氨基发生交联反应,之后又有63.9%的氨基被乙酰化。CMs溶胀率与pH值呈反比,ACMs溶胀率受pH值影响较小。同时,两种微球溶胀率受环境温度影响都很大,随着温度升高而增加。微球热稳定性良好,在121℃、150kPa加热1h无明显变化,室温静置3个月后,形态依然完整。ACMs在溶菌酶的作用下酶解速度大于CMs,8周后两者质量分别下降了58.1%和40.7%,降解后的微球表面凹凸不平、出现空腔。 两种微球均能吸附BSA,由于CMs上氨基更多,所以蛋白吸附量比ACMs的大,达到吸附平衡时间也长。ACMs在低浓度(10mg/ml)和高浓度(50mg/ml)时溶血率均小于5%,而CMs在高浓度时明显溶血;ACMs所诱导的血栓形成反应较小,血栓量明显少于CMs,结果说明ACMs具有良好的血液相容性。MTT法比较了两种微球对胎鼠成纤维细胞(MEFs)的毒性,MEFs细胞能在稍小粒径(132μm、260μm)的两种微球上生长良好,而在大粒径(429μm)上无法生长,MEFs在CMs上的增殖率随着孵育时间的延长而降低,但在ACMs上增殖率随着孵育时间的延长而上升。通过蛋白吸附、血液相容性、细胞毒性实验表明ACMs具更好的血液相容性和细胞相容性。 对两种微球进行体内生物安全性评价。材料浸提液无皮肤致敏性和刺激性,对兔眼角膜也无刺激性。以高剂量(0.5ml/10g)通过尾静脉注射比腹腔注射对动物的刺激略大,注射后24h时体重下降,但之后恢复正常,而腹腔注射对小鼠无影响,表明材料浸提液无潜在急毒性。将微球植入大鼠肌肉后,术后3d、7d、14d时对大鼠肝、肾功能无影响;但植入炎症反应导致WBC水平升高(P0.05),7d后之后恢复正常;微球在体内逐渐被降解,没有引起明显的组织排异反应,有良好的组织相容性。ACMs栓塞兔耳动脉3d后,兔耳发炎水肿,耳尖由于血管被堵出现发黑、结痂现象;栓塞后7d,兔耳消肿,耳尖明显发黑、结痂、缺血性坏死;栓塞15d,耳尖部位小动脉萎缩消失,周围组织干性坏死,部分发生脱落,与坏死组织交界的边缘表皮萎缩增厚;结果表明ACMs有明显栓塞效果。 检测了盐酸阿霉素(ADM HCl)载药微球的包封率、载药量及体外缓释行为。两种微球包封率和载药量分别为54.8±1.23%、11.1±0.61%,由于脱水作用,导致未干燥的CMs的药物包封率和载药量均高于干燥后的微球(分别为62.53%、13.67%)。载药微球体外释药研究表明,两种载药微球在pH4.0介质中缓释率要在比在pH7.2介质中大,且ACMs缓释效果优于CMs,存在明显缓释作用。 实验发现壳聚糖微球,尤其是乙酰化壳聚糖微球具有良好的血液相容性、细胞相容性、组织相容性,生物安全性高,栓塞效果明显,可以作为临床上潜在的血管栓塞材料。


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