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栉孔扇贝Cf-foxl2基因的克隆、表达模式及功能初探

刘晓玲  
【摘要】:FOXL2是叉头框转录因子家族成员之一,迄今已在多个物种中获得了该基因的序列,然而较深入和系统的研究仅在高等哺乳动物中进行,并确定其参与哺乳动物的卵巢早期发育、分化以及成体卵巢的功能维持,属于雌性相关基因。目前,无脊椎动物中该基因的系统研究还很有限,且尚未见该基因作为无脊椎动物雌性特异基因的相关报道。 本研究以重要的经济养殖物种——栉孔扇贝(Chlamys farreri)为研究对象,克隆获得了foxl2的cDNA全长序列,分析了它的序列特征;半定量RT-PCR揭示了增殖期栉孔扇贝各组织中的空间表达;定量RT-PCR和原位杂交技术分析了该基因在个体发育过程及成体性腺周期中的表达特征;定量RT-PCR技术分析了外源17β-雌二醇对该基因表达的影响;初步探讨了该基因在贝类中可能的功能。 本研究获得的栉孔扇贝foxl2(Cf-foxl2) cDNA序列全长1824bp,编码369个氨基酸,具有保守的叉头框DNA结合区。保守区C端含NTL(细胞核定位信号)序列(RRRRRMKR),蛋白三维结构预测显示,Cf-FOXL2叉头框含3个α螺旋及2个翼状结构。 RT-PCR结果显示其主要在卵巢中表达;其次在肝脏中有很微弱地表达;在精巢及其他组织中无可见表达;初步显示其在精卵巢中的二态性表达特征。 定量RT-PCR研究发现,Cf-foxl2呈母源性表达;在幼虫结构迅速建立的D形期幼虫表达量较高,之后随着幼虫的发育,表达量显著下降;至个体性别分化后表达量明显上升。原位杂交结果显示阳性信号在担轮幼虫之前皆均匀分布;担轮幼虫出现信号集中,主要集中在腹面的口凹附近,对称存在于虫体两侧;D形幼虫时信号强度明显增强,除集中于内脏团外,在外套膜边缘也有强信号出现,之后信号渐弱直至消失;当个体发育到9mm幼贝时,此时从性腺组织学上刚刚可以分辨雌雄,Cf-foxl2阳性信号仅在雌性生殖细胞及周围的体细胞中出现,在同时期的精巢中未见表达;暗示该基因可能是栉孔扇贝雌性性别表型形成的早期标记基因,可能参与扇贝卵巢的分化。 比较Cf-foxl2mRNA在栉孔扇贝成体性腺发育周期中精卵巢的定量RT-PCR结果发现,Cf-foxl2在各时期卵巢中的表达均显著高于同时期精巢中的表达,呈明显的性别二态性表达模式,其中增殖期卵巢是精巢表达量的63倍。在卵巢中,增殖期卵巢的表达量明显高于生长期和成熟期,前者是后两者的3倍,该表达规律与小鼠及青鳉等物种中foxl2的表达规律类似,推测与其在卵巢发育过程中的作用相关相关;在精巢中,Cf-foxl2mRNA仅在成熟期有非常微弱的表达,增殖期与生长期的精巢中无明显表达。成体性腺的原位杂交结果显示,Cf-foxl2的阳性信号在各时期卵巢中的分布位点与其在幼贝雌性性腺中相同,但在成熟个体的精巢中除精子外的其它细胞(生殖细胞和体细胞)中也有微弱信号出现;有趣的是,与胚胎、幼虫和幼体不同,阴性探针在成体两性性腺中均有表达信号,推测成体性腺中可能存在反义RNA,以调控foxl2基因的表达。 采用闭壳肌注射外源17β-雌二醇的方法,检测其对Cf-foxl2表达的诱导发现,成体卵巢与精巢中的Cf-foxl2表达量较对照组都有明显提高(p<0.05),推测17β-雌二醇对该基因有反馈作用。 综上,在结构上,Cf-foxl2基因的叉头框与已报道其它物种的foxl2基因叉头框部位高度保守;其在个体发育中的表达图式显示该基因呈母源性表达,是卵巢表型形成的早期标记基因;其在成体中的表达模式与已报道的脊椎动物一样,呈现明显的性别二态性表达;进一步发现,外源17β-雌二醇可诱导Cf-foxl2mRNA的体内合成。该基因在栉孔扇贝卵巢中的功能以及与卵子发育的相关性尚需进一步研究。


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