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发光细菌FMN:NADH氧化还原酶的提取纯化及应用

俎聪  
【摘要】:本文首先筛选出产酶活力高的菌种P. phosphoreum DB,利用超声波破碎、渗透压冲击、层析分离等方法将发光细菌中的FMN:NADH氧化还原酶进行了纯化,为该酶的进一步研究提供了便利。同时,还进行了双酶(荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶)的应用研究:优化了P.phosphoreum DB双酶体外发光条件,并初步探究了发光细菌P.leiognathi YL、P. phosphoreum DB的混合双酶体外发光特性,通过尝试不同的体积配比,使混合双酶发光强度达到最大,这为提高双酶体外发光体系检测NADH的灵敏度提供了新思路。 1、从实验室冻藏的7株发光细菌中筛选出一株FMN:NADH氧化还原酶活力高的菌株。发光细菌DB、h1、h2、h5、Hw1、YL、XB通过培养、离心收集、超声破碎、Sephadex G-25脱盐等相同操作后,测定FMN:NADH氧化还原酶活力,经过三次平行实验得出发光细菌DB明显具有较高的FMN:NADH氧化还原酶活力,因此将发光细菌DB作为氧化还原酶的提取来源。DB属于明亮发光杆菌(P.phosphoreum),发光柔和呈蓝绿色,最大发射波长为473nm,发光稳定,可持续发光10h。 2、从P.phosphoreum DB中提取纯化FMN:NADH氧化还原酶。细菌经过培养、离心收集后,分别用超声波破碎、渗透压冲击法破碎细胞得到粗酶液,然后经过层析方法进一步纯化。结果表明,无论是用超声波破碎法还是渗透压冲击法破碎细胞,两种纯化过程都能得到电泳纯的FMN:NADH氧化还原酶,经SDS-PAGE初步鉴定该酶为单体酶,分子量为28kD。 3、建立P.phosphoreum DB双酶体外发光体系,确定体外发光体系各底物的添加量为:NADH(0.01mmol/L)400μL、FMN-Na2(10mmol/L)1.5μL、十二烷醛(27mmol/L)125μL。初步研究了提取自P.leiognathiYL、P.phosphoreumDB的双酶混合比例对发光强度的影响。当底物NADH浓度为0.1mmol/L时,P.leiognathiYL和P.phosphoreumDB双酶以1:1的体积比混合时体系发光强度最高;当底物NADH浓度为0.01mmol/L时,P.leiognathiYL和P.phosphoreumDB双酶以3:2的体积比混合时体系发光强度最高。


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