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黄河三角洲盐碱地真菌多样性及活性次级代谢产物的初步研究

刘德胜  
【摘要】:特殊环境(包括深海、火山口、高热、超低温、高盐、红树林、沙漠等)来源微生物一直以来受到生物、化学、生态学等领域的广泛关注。其中滨海盐碱地具有高盐、高pH值等特殊物理化学性质,生存于其中的真菌有可能形成独特的代谢机制进而产生新颖的活性次级代谢产物,成为药物先导化合物发现的一个潜在资源。为探索这一特殊环境来源的真菌及活性次级代谢产物,本论文对黄河三角洲辖地滨州沾化市临海盐碱地的真菌进行了分离并初步研究了其物种多样性;对所得菌株进行了活性筛选和化学筛选,对从中得到了5株活性菌株进行了次级代谢产物的研究;对所获得新化合物进行了抗肿瘤、抗菌等活性筛选和评价,并对secalonic acid F的体内抗肿瘤作用及其机制进行了初步探讨。 1.滨海盐碱地真菌物种多样的初步调查以及抗菌、抗肿瘤活性研究:对隶属黄河三角洲滨州沾化临海重度盐碱地进行了真菌分离,共获得26株真菌;结合形态学、和分子生物学鉴定方法,确定这些微生物的种属(隶属6科,8属),分别是丛梗孢科的青霉属(Penicillium)真菌5株、曲霉属(Aspergillus)真菌15株,球腔菌科的枝孢霉属(Cladosporium)真菌1株,赤壳科的镰孢霉(Fusarium)属真菌1株,肉座菌科的支顶孢属(Acremonium)真菌1株、木霉属(Trichoderma)真菌1株,毛霉菌科毛霉属(Mucor)真菌1株以及双足囊菌科的白地霉属(Galactomyces)真菌1株。曲霉属(Aspergillus)真菌占分离菌株总数的57.7%,其次为青霉属(Penicillium)真菌,占19.2%;多样化程度较高。并用Mega5.0软件构建了系统发育树。 以抗菌(革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌,柠檬色葡萄球菌,白色葡萄球菌和革兰氏阴性菌:大肠杆菌,变形杆菌,伤寒杆菌,绿脓杆菌)、A549肿瘤细胞增殖抑制实验为活性筛选模型,初步评价了所得菌株的抗菌和抗肿瘤活性。结果表明,所测试真菌对至少一种受试菌具有抑制作用(φ抑菌圈≥8mm)的菌株占比例达46.5%;对A549肿瘤细胞增殖抑制IC50值在50μg/mL内的有8株菌株,占总数的30.7%。说明该地域的真菌具有一定的抗菌作用和抗肿瘤作用;结合高效液相(HPLC-DAD)指纹图谱为化学筛选共得到5株具有一定研究价值的真菌。 2.对5株盐碱地来源的真菌次级代谢产物进行了较为系统的研究:大量发酵后,应用天然产物分离的方法(重结晶法、沉淀法以及薄层色谱、正反相硅胶色谱、LH20凝胶色谱、半制备高效液相色谱等)对5株真菌的次级代谢产物进行了分离,应用现代波谱技术(UV、IR、NMR、MS、X-ray等)鉴定了所得化合物的化学结构;从Aspergillus fumigatesJH43中获得了16个化合物(包括1个新化合物,结构包括桥环类化合物、螺内酰胺类生物碱、色氨酸和脯氨酸衍生的吲哚生物碱、二氧哌嗪类、甾醇类)。从Aspergillus iizukaeKL33中分离得到11个化合物(2个新化合物,1个新天然产物),结构包括二联苯类、蒽醌类、苯酚类;从Penicillium janthinellum KL24中分离得到11化合物,结构包括二氧哌嗪类、嘧啶生物碱类、丁烯酸内酯类、二倍半萜类、甾醇类;从Aspergillus aculeatus WD5中得到8个化合物,结构包括呋喃甲酸类、苯甲酸类、蒽醌类、二聚四氢酮类;从Aspergillus clavatonanicus WD8中得到10个化合物,结构包括:甾醇类,苯甲酸类,苯酚类,蒽醌类,羧酸类,六元内酯类,氨基酸和二氧哌嗪类。结果表明滨海盐碱地来源真菌次级代谢产物具有高度的结构多样性。 生物活性评价表明,化合物iizukaeA具有一定的抗菌活性;iizukaeA和iizukae B对HL-60,A-549和BEL-7402肿瘤细胞有弱的抑制作用。 3.初步探讨了secalonic acid F (SAF)的体内抗肿瘤活性及作用机制。 菌株WD5Aspergillus aculeatus中产量较大的SAF具有显著的抗肿瘤活性,但其体内抗肿瘤作用及其作用机制尚未见报道。本文发现该化合物能明显抑制HepG2的增殖,IC50为6.8μM,并呈现浓度、时间依赖性关系。以小鼠肝癌(H22)瘤株为模型进行体内抗肿瘤活性评价结果显示在SAF在50mg/kg剂量下,对荷H22小鼠的抑瘤率高达94.74%,优于阳性对照5-FU;给SAF处理组小鼠毛色光泽,活动灵活;且SAF在低浓度下(10mg/kg)下可以使胸腺指数略有提高,提示低剂量SAF在器官水平有提高机体免疫调节作用。进一步抗肿瘤活性作用机理研究发现该化合物能够明显诱导HepG2细胞凋亡,并初步证实细胞受刺激产生的大量的活性氧很可能作为信号分子参与或启动了SAF诱导的HepG2细胞凋亡过程。 综上所述,本论文首次对黄河三角洲盐碱地真菌物种多样性及其次级代谢产物进行了初步研究,构建了真菌的系统发育树,初步评价了所分离真菌的抗菌、抗肿瘤活性,从5株盐碱地真菌的次级代谢产物获得化合物51个,其中新化合物3个;对其抗菌和抗肿瘤活性做了初步评价;首次对SAF抗肝肿瘤活性和机制进行了初步研究,发现SAF能够明显诱导肝肿瘤细胞凋亡;动物实验发现该化合物具有一定的体内抗肿瘤活性。本研究为盐碱地真菌的研究开发提供了微生物资源,为活性先导化合物的研究与发现奠定了基础。


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