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宽裂解谱沙门氏菌噬菌体的基因组学分析及其重组内溶素抑菌活性研究

李萌  
【摘要】:沙门氏菌为革兰氏阴性直杆菌,一种重要的人畜共患病原菌,它导致的食源性疾病爆发事件在国内外率居前位。随着耐药性沙门氏菌的出现,沙门氏菌的防控变得更加困难。因而,开发新的沙门氏菌防控方法迫在眉睫。噬菌体能够高效专一的裂解宿主细菌,广泛存在于环境中,其中宽裂解谱噬菌体或其编码的内溶素在致病菌的防控研究方面展现了良好的抑菌效果,具有广泛的应用前景。 本研究分离纯化得到一株新型烈性沙门氏菌噬菌体STP4-a,通过生物学性质和基因组学研究,发现它具有裂解谱宽、裂解性能稳定和无毒力因子安全隐患的特点,具有作为抑菌剂应用的潜力,后期针对该株噬菌体裂解细菌过程中的5种主要蛋白进行结构分析和功能预测,分析STP4-a的裂解机制并对裂解过程中关键酶内溶素进行克隆表达获得有裂解活性的重组蛋白。这不仅为全面认识沙门氏菌噬菌体基因组和裂解机制的多样性提供了丰富的数据资源,也为利用内溶素防控耐药性沙门氏菌提供了理论基础和技术指导。论文的主要研究结果如下: 以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为宿主菌,采用双层平板法和点滴法分离纯化得到一株烈性噬菌体,生理学性质研究表明该株噬菌体从电镜形态上属于有尾噬菌体目中的肌尾噬菌体科,能够高效裂解5种不同血清型的沙门氏菌,可耐受50°C的高温条件和4~12范围内的pH环境,在-20°C条件下保存一年仍有90%的裂解活性。 采用Roche454的GS FLX+测序系统和Newbler v2.6拼装系统,完成STP4-a基因组的全序列测序工作,利用DNAstar、Glimmer3.0、NCBI提供的ORF Finder、BLAST和ClustalX等软件进行功能基因组学分析,结果表明STP4-a遗传物质为双链DNA,全长为159,914bp,GC平均含量为36.86%,有4个tRNA编码序列。该基因组含257个ORF,占全长的92.79%,经过BLAST比对,推测出的257个ORF中有251个基因可找到同源性序列,128个基因已确定了功能。基因组注释结果表明STP4-a不含有毒素因子或转导因子,说明这株新型宽裂解谱噬菌体在基因方面是安全的,具有作为生物抑菌剂的实际应用价值。通过氨基酸多序列比对和构建系统发育树,证明STP4-a属于T4型噬菌体属,进一步的对比分析结果表明STP4-a为第一例被鉴定出的Pseudo T-evens亚群沙门氏菌噬菌体。该株噬菌体基因组序列信息已在Genbank中收录,登录号为No.KJ000058。 通过相似序列的数据库比对,序列模体数据库比对和确定序列特性三个方面对STP4-a基因组中编码孔蛋白、抗孔蛋白、Rz1蛋白、Rz蛋白和内溶素5个与裂解作用紧密相关的基因进行详细的结构分析,确定了STP4-a的裂解细菌机制是以内溶素为主导,其他4种蛋白参与调控的作用方式。通过二级结构和三级结构分析,证实STP4-a噬菌体编码的内溶素为裂解细菌细胞壁中β-1,4糖苷键的糖苷酶,具有作为抑菌剂应用的潜力。 为了更好的分析STP4-a噬菌体内溶素作为抑菌剂的可行性,选取pET克隆表达系统,进行了内溶素的克隆表达。经诱导表达,内溶素重组蛋白LysSTP4的表达形式为可溶性蛋白,通过镍离子金属螯合柱纯化和超滤离心管脱盐的方法得到高纯度,蛋白浓度为400μg/mL的LysSTP4。采用亚甲基蓝染色法、浊度法和平板法鉴定得知LysSTP4具有裂解活性,这也是国内外首例T4型沙门氏菌噬菌体内溶素克隆表达成功。通过酶活特性分析,得知与源噬菌体相比较,LysSTP4不仅能够裂解不同血清型的沙门氏菌,还能够裂解大肠杆菌,比源噬菌体的裂解谱更宽泛。LsySTP4在pH5~10和30~50°C的条件下都能保持较高的活性,在-80°C条件下保存6个月仍有85%的活性,与膜通透剂EDTA协同作用能够有效抑制沙门氏菌的生长。这些研究结果表明LysSTP4作为革兰氏阴性细菌抑菌剂具有非常大的应用前景。


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