利用密度感应抑制技术控制水产养殖细菌性病害的基础研究

【摘要】：水产养殖业是全球食物生产增长最快的系统之一，但是病害频发阻碍了其进一步健康地发展。目前，抗生素是公认的治疗细菌性疾病的有效方法。抗生素的滥用使药物残留问题严重，并进一步加快了细菌抗药性的出现。密度感应（quorum sensing, QS）是微生物之间的一种交流机制，用于调控基因的表达以及协调微生物的群体性行为，如生物被膜的形成、生物发光和毒力因子的分泌等。研究发现在多种致病菌中，致病因子的分泌和QS密切相关。抗生素的滥用使得细菌抗药性问题越来越严重。由于QS不是微生物生存所必需的，因此淬灭致病菌的密度感应系统（quorum quenching, QQ）可以在不杀死细菌的情况下大大地降低其毒力因子的表达，同时降低环境中的选择压力和出现细菌抗药性的几率，因此密度感应淬灭技术是一种极具开发前景的细菌性病害的控制手段。相关研究表明海洋中蕴含着丰富的QQ酶资源，而目前发现的QQ活性物质特别是QQ酶主要来源于陆地微生物。本论文建立了一种高通量的QQ菌株筛选方法，从牙鲆体内及养殖环境中分离筛选土著QQ菌株，对具有强QQ活性的耐油具柄菌（Muricauda olearia）Th120的QQ活性物质进行了鉴定，并完成了该菌株的全基因组测序及分析。本论文研究结果可为发展以密度感应淬灭技术为基础的、健康可持续发展的水产养殖细菌性疾病的预防和控制手段提供理论基础。 为了能从数量庞大的海洋微生物中快速鉴定QQ细菌，本论文建立了一种简单快速的QQ菌株高通量筛选方法。该方法采用的AHL报告菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）对AHL分子具有高灵敏度的检测能力，为达到高通量筛选的目的，在检测方法上主要有两个关键步骤：一方面通过标准化检测吸光度值，消除报告菌细胞的影响，从而大大提高了检测的准确度并实现β-半乳糖苷酶活性的定量检测；另一方面通过使用缓冲液PIPES，有效地排除了因pH值过高而导致的假阳性QQ菌株。该方法能同时对大批量的待测菌株进行高效地筛选。利用该方法从分离自健康牙鲆肠道、鳃、粘液以及养殖环境的366株土著菌中筛选到了25株QQ细菌。这些QQ细菌分别属于黄杆菌纲、α变形菌纲以及γ变形菌纲的14个种，其中12个种的细菌其AHL降解活性为首次报道。进一步研究发现，这些QQ细菌的AHL降解特性各不相同，部分菌株的AHL降解活性被证明是内酯酶活性。具强QQ活性的海黏奥雷氏菌（Olleya marilimosa）T168、居珊瑚假交替单胞菌（Pseudoalteromonas prydzensis）Th125以及耐油具柄菌（M.olearia）Th120能够提高斑马鱼抗嗜水气单胞菌侵染的能力，表明其具有进一步开发为水产养殖有益菌的潜力。 对强QQ活性菌株耐油具柄菌Th120的进一步研究发现，该菌株可能同时具有QQ酶和QS小分子阻抑物。利用胶内QQ活性检测、蛋白质谱检测以及全基因组测序技术发现菌株Th120的5个蛋白具AHL降解活性。包括一个AHL内酯酶及一个AHL酰基转移酶，分别将其命名为MomL（Muricauda olearia marinelactonase）和MomA（M. olearia marine acylase）。在已鉴定的AHL内酯酶中，MomL与AiiA的氨基酸序列相似度最高（一致性为28.85%）。MomL具有信号肽序列，是目前金属-β-内酰胺酶家族中唯一一个分泌到胞外的AHL内酯酶。MomL具有高效的AHL降解活性，对C6-HSL的降解效率是AiiA的10倍左右，能降解不同碳链长度（C4-C14）的AHL分子，对长链以及3号碳位带羰基的AHL分子具有更高的降解效率。MomL的最适反应温度为40°C，经60°C处理30min后，保留32%的活性。MomL是一种金属蛋白，对Mg2+的亲和性高，但是不易结合Co2+，推测Be2+可促进其AHL降解活性，而AiiA的结合金属主要是Zn2+。定点突变研究发现氨基酸残基位点His117，His119，Asp121，His122，His189和His214对其AHL降解活性是必需的。BLAST检索发现MomL的同源蛋白主要分布于海洋黄杆菌科细菌中，因此MomL的分泌特性、AHL降解机制以及活性位点等结果均表明其代表一类新型海洋AHL内酯酶。重组MomL能够有效抑制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）胞外蛋白酶的分泌以及绿脓菌素的产生，表明其具有进一步开发应用的潜力。 采用Illumina高通量测序技术对Th120的全基因组进行了测序及分析，经RAST服务器分析后共得到17条contigs和11条scaffolds序列，测得的基因组大小为3.94Mbp，G+C含量为43.86%。共预测到3730个基因。通过COG，KEGG等数据库对菌株Th120基因组的注释分析发现，相比于其他代表性的海洋黄杆菌科细菌，菌株Th120中参与糖类转运与代谢、转录、信号转导、无机离子的转运和代谢以及防御机制等生物过程的基因比例较高。其中铁元素代谢相关的基因尤其丰富，Th120含有22个铁运输相关的基因，其中5个为铁载体受体蛋白编码基因。菌株Th120中主要由SufABCDSE组成的SUF系统来合成Fe-S簇，而MomL的编码基因处于suf操纵子之内；由于MomL的活性受Fe2+的抑制作用，因此推测MomL可能参与调控Fe-S簇的合成。此外，通过本地BLAST检索预测到一个N-酰基氨基酸水解酶，可能具有降解N-酰基高丝氨酸（MomL降解AHL的产物）的活性。本论文筛选到的QQ细菌中，海黏奥雷氏菌T168、鳎鱼附着杆菌（Tenacibaculum soleae）T133和异色附着杆菌（T. discolor）T84都属于黄杆菌科细菌，其中菌株T168和T133的AHL降解活性被证明为内酯酶活性，但是这三种细菌的QQ酶编码基因还未得到鉴定。以AHL降解酶MomL和MomA的氨基酸序列为基础，结合NCBI数据库中的附着杆菌属以及奥雷氏菌属的细菌的全基因组序列，预测发现海黏奥雷氏菌、鳎鱼附着杆菌和异色附着杆菌可能都具有MomL的同源蛋白，而鳎鱼附着杆菌和异色附着杆菌同时具有MomA的同源蛋白。 综上所述，本论文建立了一种QQ菌株的高通量筛选方法，用这种方法筛选到25株共14个种的QQ细菌，其中12种细菌的QQ活性为首次报道。耐油具柄菌Th120有5个蛋白具有AHL降解活性。QQ酶MomL代表一类新型海洋AHL内酯酶，其同源蛋白可能普遍存在于海洋黄杆菌科细菌中。对Th120的全基因组分析发现其铁元素代谢相关基因比例较高，而MomL可能参与调控Fe-S簇的合成。本论文研究结果可为发展健康可持续发展的水产养殖细菌性疾病的预防和控制手段提供理论基础。