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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)R-spondin1和R-spondin3基因的克隆与表达分析

刘田田  
【摘要】:半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国极其重要的海洋养殖经济鱼类,雌雄个体差异较大。R-spondin(Rspo)蛋白家族共有4位成员,Rspo1-4,为分泌性蛋白。Rspo蛋白家族成员含有相似度很高的保守结构域:2个富含半胱氨酸的furin-like结构功能域(furin-like cysteine rich domain,FU)和1个血小板反应蛋白结构域(thrombospondin-type 1 domain,TSP1)。已知所有的成员蛋白均能与Wnt信号通路相互作用,在脊椎动物发育过程中发挥着不同的功能。Rspo1基因作为一个卵巢决定和分化的最佳候选基因,在性别决定、皮肤分化和恶性肿瘤等方面都具有重要的功能。Rspo3基因能调控造血干细胞命运、促进血管生成、调控哺乳动物胎盘发育等等。本实验主要是通过同源克隆技术和RACE PCR技术(Rapid amplification of cDNA ends PCR)分离出半滑舌鳎Rspo1基因和Rspo3基因的cDNA全长,利用原位杂交和荧光定量PCR对其基因表达进行了研究,结合所得到的结果通过生物信息学分析,对这2个基因的功能进行了预测。具体总结如下:(1)半滑舌鳎Rspo1基因的克隆和表达分析利用同源比对得到的简并引物和RACE引物,克隆分离出半滑舌鳎Rspo1基因ORF全长为834 bp,编码277个氨基酸,分子量大小约为30.52 kDa。蛋白质结构预测其含有FU1、FU2、TSP1结构域,分别位于31-86、93-137和154-216处,蛋白比对结果表明半滑舌鳎Rapo1基因氨基酸序列与其他物种尤其是海洋鱼类的Rspo1基因氨基酸序列相似度比较高,系统进化树的分析也验证了上述结果。进化树明显的分为两大枝:鱼类该基因分化较大,物种间相似度只有40%-60%,而四足类动物中达到了99%以上。分析预测启动子区的转录因子,发现存在性别相关转录因子Sox-5,SRY的结合位点,这对研究该基因功能提供了帮助。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明半滑舌鳎Rspo1基因在胚胎时期的表达主要是从克氏泡时期之后开始明显升高。鉴于其在性别分化中的作用,我们比较了该基因在雌雄组织中的差异表达,发现雌雄各组织中均有表达,其中卵巢中的Rspo1基因表达量显著高于精巢,是精巢表达量的2倍,这与先前的报道结果相一致,暗示了Rspo1基因在性别决定中的重要作用;非性腺组织如脑、心等也有表达但雌雄表达差异很小。性腺组织切片原位杂交结果显示Rspo1基因主要定位在半滑舌鳎卵巢的卵母细胞的细胞核以及精巢的精原细胞和精母细胞中,精细胞中无信号,这与斑马鱼中Rspo1基因的研究结果相一致。相同浓度探针杂交后卵巢中的信号要比精巢中的强,也间接说明Rspo1基因在卵巢中的表达量高于精巢。借助斑马鱼这个模式生物,我们探究了体外注射半滑舌鳎Rspo1基因对于斑马鱼发育以及Wnt信号通路的影响。注射半滑舌鳎Rspo1-GFP质粒后绿色荧光信号可出现在身体的大多数位置,同时导致胚胎畸形率升高;当在胚胎中过量表达半滑舌鳎Rspo1基因和Wnt3a基因mRNA后,Wnt信号通路受到了抑制。(2)半滑舌鳎Rspo3基因的克隆和表达分析同样通过同源克隆和RACE技术,分离出半滑舌鳎Rspo3基因ORF全长共987 bp,编码328个氨基酸,分子量大小约为38.07 kDa。蛋白质结构预测该基因除了含有FU1(36-88)、FU2(94-137)、TSP1(200-257)保守结构域外,还含有1个FU3(141-185)结构域。经比对分析后发现,3个FU保守结构域是鱼类Rspo3基因所特有的,哺乳动物如人类和小鼠Rspo3基因就不存在这种现象。系统进化树中Rspo3基因聚为两大类:鱼类和哺乳类,而且鱼类中明显分为海水鱼和淡水鱼,进化关系更为明确。qRT-PCR结果显示出半滑舌鳎Rspo3基因在成鱼各组织中均有表达,尤其以脑和鳃组织表达量最高。体外注射半滑舌鳎Rspo3-GFP质粒对于斑马鱼发育具有显著的影响,正常发育的胚胎荧光信号少而集中于肌肉中,畸形胚胎出现尾部蜷曲、缩短,头部发育不健全,全身萎缩等现象。将Rspo3-GFP质粒转染入体外培养的脑细胞,荧光信号出现在细胞核而非细胞质中。


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