rDNA序列在几种浮游植物的分类和中肋骨条藻定量检测中的应用

【摘要】： 利用核糖体DNA(rDNA)序列对浮游植物进行亲缘关系分析和系统学研究往往会获得许多有价值的研究成果，已成为传统形态学鉴定的重要补充手段。同时，以rDNA序列多样性为基础建立浮游植物的定量检测方法，是目前浮游植物生态学研究的热点之一。 本论文首先对分离自胶州湾的十一种浮游植物的rDNA序列进行了PCR扩增、克隆、序列测定、序列相似性分析，并利用测得的小亚基(SSU)rDNA序列分析了这些浮游植物的系统进化关系。结果发现三株角毛藻的rDNA序列相似性非常高(全序列的相似性均大于99％)，进化距离也非常接近；而两株裸甲藻(一株裸甲藻未鉴定种(Gymnodinium sp．，编号为GYN-15)、一株米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi))虽然进化距离接近，但它们的rDNA序列相似性却很低，全长序列的相似性仅为54.1％。 在上述工作的基础上，本论文从以下几方面作了进一步的研究： 1．初步建立了定量检测中肋骨条藻的新方法——实时荧光定量PCR(Realtime Fluorescent Quantitative PCR，RFQ-PCR)。 首先以中肋骨条藻的rDNA序列为设计种特异性引物的靶区域，共设计出7对适合RFQ-PCR的引物(依次命名为Primer 1(F／R)～Primer 7(F／R))，并用常规PCR实验初步证明其中有4对引物(Primer 1(F／R)、Primer 2(F／R)、Primer 5(F／R)、Primer 6(F／R))可作为中肋骨条藻特异性引物的候选者；然后测定了以Primer6(F／R)为引物的PCR产物的序列，序列分析表明，中肋骨条藻的PCR产物序列与其他藻的PCR产物序列差别较大，从中可设计出满足RFQ-PCR需要的TaqMan探针(命名为TaqMan 6)；进一步的核酸杂交实验表明，TaqMan 6只与中肋骨条藻的PCR产物杂交，不与其他藻的PCR产物杂交。最后以Primer 6 rDNA序列在几种浮游植物的分类及中肋骨条藻定量检测中的应用 (F/R)和TaqMan6探针建立了定量检测中肋骨条藻的RFQ一PCR。以RFQ一PCR中 实际细胞数的常用对数值为横座标，以测得的CT值为纵座标，绘制出了定量检 测的标准曲线，该曲线的回归方程为:y=一3.3427x+43.443，其相关系数是: RZ二0.9788，CT值的标准估计误差为Sy’x二0.6741。在蚌1 .3212的区域，可保 证95%的准确率。该标准曲线的CT值检测范围为20.17士1.3212一33.54上1.3212， 对应的细胞数为106乡623士0·39，2一xoZ·962，土03952个。用己知细胞数的样品验证表明， 该曲线是准确可靠的。 2.对裸甲藻属未鉴定种(GYN一15)进行了初步鉴定。 该藻的roNA序列全长2658 bp，涵盖了sSU roNA基因3’端1747 bp、 ITsl一5.85 rDNA一ITSZ全长、LSU rDNA基因5’端337bp。以此序列作BLAsTn 分析发现GYN一巧与共生甲藻属(今mbi口dinium)中的两株藻(一株是 砂功biodinium eal如rnsum，共生于海葵体内;一株是Gymnodinium varians，自 由生活)的相应序列具有很高的相似性。进一步的序列比较表明，这三株藻的各 段rDNA序列的相似性均大于99%。以SSU rDNA序列中的三个可变区 (Vz+vZ+V3)和邻接法困eighbor一Joining Method，NJ法)构建共生甲藻属的系统 进化树表明，GYN一巧与5. cal扣rnium和G.varian:在共生甲藻属内构成一个独 立的、自检支持百分率为100%的子类群(clade)，根据这些结果可将GYN一巧初 步鉴定为属于共生甲藻属。另外，鉴于GYN一巧所在的子类群与其它五个己报 道过的子类群(c ladeA一E)明显分开，因此建议将其命名为cladeF。 3.对三株角毛藻的亲缘关系和遗传差异进行了研究。 所测定的旋链角毛藻、柔弱角毛藻和纤细角毛藻的rDNA序列全长分别为 287obp、2867bp、2868bP。以ssU rDNA序列和NJ法构建的系统进化树表明三 种角毛藻与其它几种角毛藻的进化距离相对较远，而它们之间的进化距离却很 接近;三种角毛藻的SSU rDNA序列相似性)99%，明显高于它们与其它角毛 藻SSU:DNA的序列相似性(82.9%一93.1%):三种角毛藻各段rDNA的序列相似 性非常高(98%一100%);三种角毛藻的任意引物PCR(AP一PcR)指纹图谱并不完 全相同。这些结果说明三种角毛藻既具有很近的亲缘关系，又存在一定的遗传 rDNA序列在几种浮游植物的分类及中肋骨条藻定量检测中的应用 差异。 通过上述这些研究，本论文发现裸甲藻未鉴定种与共生甲藻属 (今形biodinium)的两个种具有很近的亲缘关系和进化距离，初步将该藻鉴定为属 于共生甲藻属;命名了共生甲藻属中一个新的子类群—CladeF;首次发现 了不同种角毛藻之间具有很近的亲缘关系;初步建立了定量检测中肋骨条藻的 新方法—RFQ一PCR。