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卤虫(Artemia Shrimp)孵化酶的生物化学特性及孵化腺细胞的免疫细胞化学研究

钟其旺  
【摘要】: 卤虫孵化酶(HE)是由卤虫早期胚胎特异性分泌的、在孵化过程中起关键作用的一种蛋白酶。我们利用67%硫酸铵沉淀、DEAE-sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephacryl凝胶过滤柱层析,并以酪蛋白为其蛋白酶水解活性的检测底物、以卵膜为其卵壳裂解活性的特异性底物,从卤虫胚胎孵化液中分离纯化出了卤虫的孵化酶分子,其在SDS-PAGE电泳中的分子量约为98.5kDa。对孵化酶纯化样品进行生化性质和酶性质分析发现,卤虫孵化酶的最适反应温度约为40℃,最适pH为8.5左右;该孵化酶对p-APMSF、SBTI极为敏感,对PMSF、LBTI和TLCK也非常敏感,但对chymostatin、Leupeptin、Pepstatin、Bestatin、TPCK、NEM和IAM不敏感,表明该酶极可能是一种属于胰蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶。利用EDTA和几种金属离子对该酶活性进行研究发现,该孵化酶可浓度依赖性地为EDTA所抑制,50mmol/L的EDTA对该酶活性的抑制作用可达约56.5%;此外,该酶对Zn~(2+)非常敏感,2.5mmol/L Zn~(2+)可使HE的活性提高为原来的215%,而其它金属离子如Ca~(2+)、Mg~(2+)和Cu~(2+)对该酶活性没有影响或影响不显著,表明卤虫孵化酶很可能又是一种Zn-金属蛋白酶。 免疫细胞化学染色结果显示,卤虫HGC最早出现于孵化前2h,于孵化后5h消失。卤虫HGC于孵化前2h刚刚出现时,胚胎中的HE颗粒界限不明显且数量较少,颜色也很淡,遍布于整个胚体;随胚胎的进一步发育,HGC的数量逐渐增多、颜色也逐渐变深,在孵化时达到最大,之后颗粒量便开始逐渐减少、颜色也逐渐变浅;孵化后2h的幼体中,HE阳性反应减弱,于胚胎局部已开始消失,且主要集中在胚胎中央及胚胎体表,最终于孵化后5h小时消失。卤虫HGC最初出现至孵化前1h时均为全身性分布,从孵出到孵出后2h,头 卤虫孵化酶的生物化学性质及孵化腺细胞的免疫组织化学研究 部的孵化酶颗粒已经减少,而变为非全身性分布,到孵出后sh,孵化酶颗粒 已基本消失殆尽。卤虫胚胎的头部很可能是孵化酶的最早开始分泌的部位,可 能也是主要的分泌部位,随着胚胎的继续孵出,身体背部继而腹部等部位也开 始分泌孵化酶,以协助胚胎完全孵出。孵出后仍残留的孵化酶有可能参与了卤 虫幼体内残余卵黄颗粒的消化降解,此结论还需进一步验证。


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