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鲨鱼肝实质细胞培养及其细胞膜分离纯化的方法学研究

于淼  
【摘要】: 细胞膜糖链是细胞识别、细胞黏着、运动迁移、免疫应答、物质运输、信息传导、细胞分裂、细胞分化、衰老、病变以及癌变的分子基础。为了研究细胞膜糖链在肿瘤的发生发展过程中所起的作用,我们以条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)肝实质细胞膜上的糖链为研究对象,通过分离肝实质细胞,制备细胞质膜,为研究细胞膜天线在肿瘤发生以及转移中的作用奠定基础。 在条纹斑竹鲨肝实质细胞的分离的实验中,我们比较了三种肝实质细胞的分离方法,包括组织块培养法,胰蛋白酶消化法,胶原酶离体灌流法。对组织块培养法,比较了各种培养条件,包括培养基、温度、渗透压、血清,得出了条纹斑竹鲨肝实质细胞原代培养的最佳条件是:L—15培养基中添加0.0351g/ml NaCl与20%胎牛血清,在27℃下密闭培养,7~9天后,可以长成细胞单层。与组织块培养法和胰蛋白酶消化法相比,胶原酶离体灌流法大大提高了细胞产率,每克肝脏可得到2.7℃10~7个实质细胞,该方法更有利于后续实验的继续进行。 在通过两步灌流法分离获得了大量的条纹斑竹鲨肝实质细胞后,我们采用了低渗溶胀法破碎细胞,超速离心和蔗糖密度梯度离心相结合分离纯化得到细胞质膜,经电镜检测结果鉴定,膜制品均一性好,酶学分析表明,细胞膜标志酶—5′-核苷酸酶在膜制品中含量是细胞匀浆液中含量的7倍,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,鲨鱼肝脏细胞膜表面蛋白种类至少有10种,其中分子量分别为95.8KD,85.6KD,77.2KD,59.5KD,8KD的蛋白明显可见。


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