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栉孔扇贝(Chlamys farreri)大规模死亡病原—AVND病毒单克隆抗体的制备及检测技术研究

付崇罗  
【摘要】:栉孔扇贝(Chlamys farreri)作为我国北方沿海特有的优良养殖贝类,曾经是重要的出口创汇产品。自20世纪90年代起,栉孔扇贝的大规模死亡现象在广大养殖区域愈演愈烈,从而给我国的扇贝养殖事业造成了重大经济损失。 在国家“973”项目的资助下,自2000年开始,作者所在课题组利用组织病理学、电镜检测技术以及多抗ELISA检测等方法对此病害进行了系统的流行病学、病原学、病理学以及人工感染实验研究。结果显示,一种球形病毒是导致该病害爆发的直接病原,并将“扇贝大规模死亡”这一现象明确定义为“急性病毒性坏死症”(Acute virus necrobiotic disease,AVND)。 该论文既为我们成功地分离出AVND病毒的基础上,进一步开展的有关该病毒特异性单克隆抗体(monoclonal andtibody,AMb)的制备以及建立单抗免疫学检测技术并对该病毒进行免疫学检测的研究。 利用蔗糖密度梯度超速离心技术从自然发病的栉孔扇贝组织分离高纯度的AVND病毒粒子,并以此为抗原注射免疫Balb/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与小鼠NS-1骨髓瘤细胞进行融合。经间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术和免疫荧光检测技术(immunofluorescence assay,IFA)对杂交瘤细胞进行筛选。最后筛选出10株与AVND病毒发生反应的阳性杂交瘤细胞株。其中,有4株细胞(2B3,3C8,3G7和4C7)在连续培养中能稳定传代并对该病毒具有较强的特异性反应。这4株单克隆抗体的亚型分别为IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG2b。应用胶体金标记免疫电镜技术在超微水平上对这4株MAbs进行的测定表明,它们对AVND病毒均具有高度的特异性,并且所识别的特异性位点均位于病毒粒子囊膜的纤突上。 进一步利用单克隆抗体建立了3种免疫学检测技术:间接ELISA、IFA和斑点免疫印迹(Dot-Immunoblot)。其中,间接ELISA所能检测病毒蛋白的最低量约为5 ng:适合于AVND病毒现场快速检测的Dot-immunoblot技术能适合于对稀释100倍的病贝组织匀浆液进行检测。 应用间接ELISA检测技术对不同养殖季节(2003年4-10月)的一龄贝进行检测发现, 栉孔扇贝(Chla尸彬心farreri)大规模死亡病原—AVND病毒单克隆抗体的制备及检测技术研究 7月中旬至8月底病毒感染率和感染强度均处于当年的最高峰,与流行病学调查中这一时 期栉孔扇贝所表现出的高死亡率完全吻合。 作为对照,组织学检测结果显示,患病扇贝各主要器官(外套膜、鳃、胃、肾等) 的上皮组织可见显著的上皮细胞肿胀、嗜碱性增强、排列紊乱、部分脱落以至完全坏死 脱落等广泛的组织病理学变化。进一步利用IFA技术对患病扇贝进行AVND病毒的原位 检测发现,这种上皮组织的病理变化与病毒的感染之间具有一致的对应关系,如仅阳性 细胞(荧光染色的细胞)呈现明显的病理改变;阳性细胞密度越高的部位,上皮细胞紊乱 以及脱落的程度亦愈加严重。这一结果清楚地表明,AVND病毒的感染可以对栉孔扇贝 这一宿主造成极其严重的组织结构上的病理性改变和损害,同时也说明,该病毒对栉孔 扇贝具有极强的致病性。由此,首次为解释该病毒导致养殖中后期栉孔扇贝爆发性大规 模死亡的机制及该病毒可能的传播途径提供了直接的组织病理学依据。


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