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双向氢化酶基因的克隆、分析及其在节旋藻和螺旋藻分子系统学中的应用

张晓辉  
【摘要】:根据GenBank中报道的蓝藻双向氢化酶基因序列设计引物,用PCR和染色体步移法得到了节旋藻双向氢化酶的基因全序列。包括心肌黄酶部分(由hoxEFU编码)和[NiFe]氢化酶部分(由hoxYH编码)共5个亚基及上游349bp的序列。其中在基因内部发现了一个推测的开放阅读框。双向氢化酶操纵子全序列长度为7081bp,其中包括hoxE基因上游349bp,hoxE 540 bp,hoxF 1596bp,hoxF和hoxU基因间ORF 1650bp,hoxU 732bp,hoxY 549bp,hoxH 1431 bp以及各基因之间的间隔区。分别对这些亚基进行了核酸序列、氨基酸分析,及二级结构和三维结构的预测。 在得到双向氢化酶基因群中发现两段具有启动子功能的序列,分别位于hoxE基因的上游,hoxF和hoxU基因的间隔区。将推测的启动子序列和启动子探测载体pEGFP-1进行重组,用热激转化法和自然转化法分别对大肠杆菌JM109和集胞藻Synechococcus sp PCC6803进行转化,并在两种受体细胞中均检测到了绿色荧光蛋白的表达,证明所得到的序列具有启动子功能。 通过Southern杂交证明在节旋藻FACHB341基因组中hoxH是单拷贝基因,通过RT-PCR方法验证了hoxH和hoxY在节旋藻FACHB341中的表达,节旋藻FACHB341中hoxH和hoxY是在非固氮蓝藻中典型的[NiFe]氢化酶基因。将完整的节旋藻FACHB341[NiFe]氢化酶基因克隆出来,与表达载体PBV220重组,转化大肠杆菌。在42℃热诱导4小时大小亚基的表达量分别达到12.1%和21.0%,即使稀释10倍也能看到明显的表达产物。 在节旋藻和螺旋藻分子系统学研究中,克隆了节旋藻和螺旋藻的[NiFe]氢化酶大小亚基基因hoxH和hoxY,并进行序列测定和分子系统学分析,结果发现,所克隆hoxH的长度为在节旋藻中为1349 bp,GC含量为45.7%~47.3%,在螺旋藻中长度为1343 bp,GC含量为50.4%~50.9%。hoxH基因在节旋藻各品系间的相似性高达95.7%~99.8%,比节旋藻和螺旋藻两个属间的相似性 双向氢化酶基因的克隆、分析及其在节旋藻和螺旋藻分子系统学中的应用 (72.9一77.0%)高。但螺旋藻属的两个品系间相似性仅为72.5%低于属间的相似 性。基于hoxH基因用MEGAZ软件中的邻接法构建了系统发生树,发现5株 节旋藻聚类在一起,bootstraP支持率达到100%。螺旋藻SP.s351与节旋藻构 成单系群,而SP.440与鱼腥藻和念珠藻聚类,bootstrap值为100,与其他节旋 藻属5个品系和螺旋藻1个品系在在进化上处于不同的分枝。 从节旋藻属5个品系和螺旋藻属1个品系中克隆了 hoxy基因的部分序列。 序列长度都是479bP,在节旋藻中该基因核酸序列GC含量为46.0%到46.6%, 螺旋藻中是43.5%。节旋藻各品系间序列的相似性介于93.7%到100%,明显高 于节旋藻属和螺旋藻属间的序列相似性69.5一72.2%。两个属中HoxY氨基酸序 列的比较也表明螺旋藻和节旋藻之间存在较大差异,尽管它们有相同的保守区 域。通过比较相应的核昔酸序列构建了系统树,表明螺旋藻和节旋藻属处于不 同的进化分枝。


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