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鱼类精子及胚胎超低温冷冻保存

张永忠  
【摘要】:鱼类精子超低温冷冻保存研究已经在上百种鱼获得成功。但是,在数万种鱼当中,这只是其中极小的一部分。另外,目前鱼类精子冷冻保存所报道的方式方法多种多样,迫切需要建立比较规范的、相对统一的技术路线。在反复实验研究的基础上,我们建立了重要底栖经济鱼类——牙鲆(Paralichthys olivacelus)和圆斑星鲽[Verasper variegates(T S)]精子超低温冷冻保存的简便易行、效果优良、便于实际应用的技术方案。从冷冻保存前后的精子运动率检测,一直到解冻精子授精率和胚胎孵化率检测等形成了比较系统、相对规范的技术路线。在各种不同配方中,经过试验优化筛选出比较理想的冷冻保护稀释液。即以人工海水为基础溶液,配制成12%的甘油(GLY)或二甲亚砜(Me_2SO)溶液作为保护稀释液,以精液:稀释液=1:2的比例稀释后,将1ml稀释精液装于2-ml冷冻小瓶(cryovial)中,从液氮罐口处以分步下降的方式分步降温冷冻。应用之前,将冷冻保存的精子在28℃水浴中解冻。牙鲆精子解冻后的运动率分别达到79.17±4.5%(GLY组)和60.5±3.6%(Me_2SO组)。采用与鲜精对照组相同的精、卵比例,授精后卵的受精率(76.2±10%,GLY组;及67.06±15.1%,Me_2SO组)和胚胎孵化率(48.18±25.7%,GLY组;及37.4±8.3%,Me_2SO组)均达到与鲜精对照组接近的水平(差异不显著,P>0.05)。把该冷冻方案应用到圆斑星鲽精子的冷冻保存中(略作改动),同样取得了比较理想的结果。而且在圆斑星鲽精子冷冻保存中,我们又新发展了在原来应用于牙鲆精子的冷冻保护稀释液的基础上再添加10%蛋黄(egg yolk,YK)的新配方,其对精子的冷冻保护效果显著优于不加YK的。冷冻保存后解冻精子的运动率达到67.5±4.0%(GLY+YK组)及65.0±4.0%(Me_2SO+YK组)。用解冻精子授精后,卵的受精率达到70.2±3.0%(GLY-YK组)和69.0±3.5%(Me_2SO+YK组),胚胎的孵化率为18.0±2.6%(GLY+YK组)和17.0±2.5%(Me_2SO+YK组)。受精率和孵化率均与鲜精对照组差异不显著(P>0.05)。这一孵化率与其他养殖鱼类相比是比较低的,可能主要是由于目前圆斑星鲽的人工养殖尚不完全成功,野生 鱼类精子及胚胎超低温冷冻保存 亲鱼在人工养殖条件下精子和卵的发育情况及质量尚不理想。 用电子显微镜观察了冷冻前后牙虾及圆斑星蝶精子的超微结构情况。发现超低 温冷冻保存会造成某些精子线粒体膨胀或从中片处脱落,某些精子尾部断掉,或头 部细胞质膜局部破裂等损伤。这些都应归结为冷冻损伤的结果,以致于解冻精子的 运动率都低于鲜精的。另外,还观察到圆斑星蝶精子头部核的前部稍偏处常常有个 不含染色质的区域。这个区域与扫描电子显微镜下看到的某些解冻后的精子头部顶 端稍偏于一侧处出现的凹陷在位置和形态上相对应。经过与其他有顶体的鱼的精 子、或在精子细胞时期有顶体遗迹的鱼中的情况,以及与棘皮动物等的精子形态进 行比较,我们认为核前部染色质空白区及其内所含的泡状结构可能是该鱼祖先精子 顶体的遗迹,并己在待发表的另一论文中专门讨论。 在鱼类胚胎冷冻方面,首先以优化筛选低毒高效的冷冻保护稀释液为目标,对 不同浓度的5种常用的冷冻保护剂在胚胎发育的正常温度(16℃)下对牙鲜胚胎的 毒性做了检测。5种冷冻保护剂(MeZSO、Me0H、PG、GLY、EG)分别用人工海 水配制成10%、巧%、20%、25%和30%五个浓度,将胚体转动期的牙虾胚胎分别 在各浓度的5种冷冻保护剂中处理60分钟后,用新鲜海水洗去冷冻保护剂,于 100一ml烧杯中培育至孵化,以孵化百分率高低来判定不同冷冻保护剂的毒性大小。 结果显示5种常用冷冻保护剂对牙虾胚胎的毒性依次为:PG Me0HMeZSO GLYEG(P0.05)。又用上述5种冷冻保护剂的各5个浓度检测它们在一15℃条件 下60分钟内对牙鲜胚胎的低温保护作用。将胚体转动期牙虾胚胎置于各浓度的不 同冷冻保护剂溶液中,慢速降温,45分钟从16℃降温至一巧℃。然后在一15℃停留 60分钟。于24℃水浴中复温后,用新鲜海水洗去冷冻保护剂,2小时后观察记录胚 胎存活率,作为判断不同冷冻保护剂在一巧℃条件下对牙虾胚胎保护作用优劣的指 标。结果显示5种冷冻保护剂对牙坪胚胎低温保护作用优劣依次为:PGMeZSO二 MeOH二GLYEG(大于号表示差异显著,尸0.05;约等于号表示差异不显著,P 0.05)。再分别以20%的一种保护剂为主配上5%的另一种保护剂,共配制成20种 不同的混合保护剂溶液,用上述同样的方法检测它们在一巧℃,60分钟对牙醉胚胎 低温保护作用的优劣。结果显示,凡是配合有20%或5%MeOH的混合保护剂溶液 对牙鲜胚胎的低温保护作用都显著优于单一保护剂的效果,而除MeOH以外的其他 鱼类精子及胚胎超低温冷冻保存 4种保护剂之间的所有配合都未发现这种效果。说明在选用了一种较为理想的冷冻 保护剂后,再加上一定比例的MeOH,将使冷冻保护剂溶液对牙醉胚胎的低温保护 效果显著提高。 对斑马鱼(Danl’orerl’o)胚胎进行了较长时期的冷冻保存探索。但是,由于没 有大的突破,只能从大量工作中总结出如下一些结果。首先比较了不同冷冻保护剂 的多种浓度及不同种类配合对胚胎冷冻保存效果的差异,结果显示MeZSO的


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