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海参(Stichopus japonicus)消化蛋白酶的初步研究

付雪艳  
【摘要】:本文首先采用了生化方法和电泳技术对海参消化蛋白酶的性质进行了初步探讨。分别观察了pH值、温度、蛋白酶抑制剂和金属离子对蛋白酶活性的影响。实验结果表明,粗酶中主要含有四种蛋白酶,其最适pH分别为2.0、5.0、8.0和13.5。通过底物—SDS-PAGE观察到三个蛋白酶分子量分别为21.6,39.1和114.1 kDa。分子量为39.1 kDa的蛋白酶在pH 8.0有较强活性,可被PMSF和EDTA抑制,表现出胶原蛋白酶活性。分子量为20.6 kDa蛋白酶的最适pH为13.5,能被EDTA完全抑制,是一种金属蛋白酶,且有较强的pH稳定性和热稳定性。经研究,不同部位的海参消化蛋白酶的活性有所差异,且随着季节而变化。 海参的超碱性消化蛋白酶(HAP)经过两次Q-Sepharose FF离子交换色谱和Sephacryl S-300分子筛层析提纯得到了纯化31.7倍的蛋白酶,经SDS-PAGE测定其分子量为20.6 kDa。对HAP进行的生化特性研究表明,它的最适pH为13.5,最适温度为37℃,且有非常好的热稳定性和pH稳定性。HAP不能分解胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的特异性底物,但可以分解天然蛋白,能被EDTA强烈抑制,被PMSF部分抑制,活性中心可能含有Cu~(2+),推测该酶为一胶原分解-金属蛋白酶。以酪蛋白为底物测定该酶的米氏常数为3.89g/L。用CD谱测定HAP的二级结构,结果表明该酶中的α螺旋结构多于β折叠结构,表征为球形蛋白结构。


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