胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因扩增及序列变异的初步研究

【摘要】：真核生物的核糖体RNA小亚基基因(Ribosomal RNA small subunit gene，18S rDNA)是常用的分子标记基因，具有进化速率慢，序列保守性高，拷贝数高的特点，常用在属或更高阶元的系统学研究中。该基因也适合作环境指示基因，用于研究环境样品的种群遗传结构，直接扩增环境微小生物的18S rDNA片段，建立18S rDNA变异类型文库，在DNA水平上剖析其群落结构组成。该方法是建立在DNA序列分析基础上的，它以环境总DNA为模板进行扩增，回避了纯培养和显微镜检过程，对认识自然环境中广泛存在的微小生物的遗传多样性具有重要的意义。国际和国内已有海洋微藻18S rDNA遗传多样性的相关报道，但用此方法对海洋小型浮游桡足类的报道还比较少。本研究的目的是建立胶州湾浮游桡足类18S rDNA的变异类型文库，通过DNA系统学分析揭示该水域浮游桡足类的多样性。 采用碱煮法提取胶州湾浮游动物总DNA，引物(247F／1701R)特异性地扩增桡足类18S rDNA的1.5kb片段，由于测通这样长度的序列需要3个反应，测序费用高，后来将引物247F和真核生物反向通用引物EK1269R结合，扩增该基因的约1kb片段，分别构建了质粒文库，对重组子进行Vsp I和Bsh NI酶切筛选不同OTU类型，并对每种OTU类型代表克隆进行测序，共获得3条1.35kb和8条1kb序列。然后，结合甲壳纲不同亚纲接近全长的18S rDNA序列进行了系统学分析。 引物247F和1701R具有良好的特异性，能从浮游生物混合样中特异性扩增浮游桡足类的18S rDNA，引物247F和EK1269R在一定程度上扩大了覆盖的种类，增加了OTU类型；两对引物都扩增出两种高丰度类群和一个低丰度类群，优势类群为哲水蚤目。根据各OTU类型的丰度计算获得的遗传多样性指数相近，分别为0.95和0.96，表明18S rDNA基因1.5kb和1kb所包含的遗传变异信息相近。 中国海洋大学2004年硕士毕业论文 该基因的保守区和变异区分布也说明1.skb和Ikb所包含的遗传变异信息相近。 遗传距离矩阵、BLAST分析和系统树构建都表明所获序列都是来源于挠足亚纲， 所获序列之间差异变化范围是0.03一1 3.3%。AY437862，AY491388，AY491390 与太平洋哲水蚤的序列同源性最高，达98%以上，分支节点支持率在99%以上， 可以确定为哲水蚤属。除AY437863和AY491391只能确定为挠足亚纲外，其余序 列都为哲水蚤目。