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海洋嗜冷杆菌的鉴定及所产低温碱性脂肪酶的基因工程和生物信息学研究

卜宪娜  
【摘要】:海洋低温脂肪酶是(Marine low-temperature Alkaline Lipase,MLAL)是由一株海洋细菌EastSeaG5-1415产生的一种胞外酶。本论文主要进行了EastSeaG5-1415菌株的鉴定低温脂肪酶多克隆抗体的制备及所产低温脂肪酶基因的克隆、序列测定、生物信息学分析和其空间结构的模建: 从东海深海底泥中筛选得到一株低温脂肪酶产生菌EastSeaG5-1415,对它进行了形态、生理生化和生长特征的观察,结合对其16SrRNA序列的分析比较,将其鉴定为嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola,并将该菌株命名为嗜冷杆菌P.glacincola EastSeaG5-1415。 利用纯化的低温脂肪酶采用背皮内多点注射和皮下组织免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫,制备得到多克隆抗体,再对其进行纯化。用ELISA的方法对其效价进行检测,结果表明其效价为64000,并用Western印迹实验证明了抗原抗体的结合具有高度特异性。 利用不完全酶切和末端半补齐技术构建了嗜冷杆菌P.glacincola EastSeaG5-1415的基因文库。末端半补齐技术的优点有:(1)彻底消除载体自环化的可能性;(2)消除了插入片段自身相互连接的可能性;(3)同常用的碱性磷酸酯酶法相比较,采用半补齐技术、处理的连接产物为完整的共价闭环质粒,不像碱性磷酸酯酶法那样留有缺口,因而半补齐法的连接产物其转化率不受影响。 采用三丁酸甘油酯平板和ELISA两种方法相结合从基因文库中筛选得到一株阳性克隆(命名为pPGl)。序列测定分析表明,此重组质粒包含有长度为此95lbp的低温脂肪酶基因的完整的开放读码框架(ORF)和上游调控序列。此片段编码由317个氨基酸组成的酶,计算其分子量为35001.83Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于嗜冷杆菌P.glacincola EastSeaG5-1415基因组DNA。并通过构建表达载体在大肠杆菌中得到了表达。 利用已有的各种生物信息学软件对得到的低温脂肪酶氨基酸序列进行了分析。同源性分析结果表明此脂肪酶含有一个G-X1-S-X2-G的保守催化序列。采用CPHmodels同源模建方法得到的模型显示,低温脂肪酶PGLip共有10个α螺旋和7个β片层,组成其活性位点的三个氨基酸残基排列顺序为Ser_(142)-Asp_(166)-His_(292)。该活性位点被包埋在脂肪酶分子内部,被一个由螺旋构成的盖子所覆盖。脂肪酶PGLip的氢键数量明显少于作为模板的蛋白质1g1h,该酶中碱性氨基酸的摩尔比例(Arg/Arg+Lys)(接近于0.27)较中温脂肪酶(0.4)和高温脂肪酶(0.48)中的比值低得多,这些特性都使脂肪酶PGLip结构变得松散,有助于形成更具柔性的三级结构,从而有助于酶在低温环境中催化作用时的构 中国海洋大学硕士论文.海洋嗜冷杆菌的鉴定及所产低温碱性脂肪酶的基因工程和生物信息学研究 象变化。 本实验结果具有一定的先进性和技术创新性,在一定程度上填补了国内低温脂肪酶 研究领域的空白,对于加速开发我国海洋生物活性物质资源有重要的理论和实际意义。


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