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西北太平洋深海沉积物微生物多态性分析

穆春华  
【摘要】:利用分子生物学的方法来研究微生物生态,DNA质量起着十分重要的作用。其中包括:一DNA量的多少、二DNA的完整性、三所提DNA是否能代表微生物的种群多样性。1)本研究通过比较Zhou,Bath,Microwave及PVP等四种方法对DNA提取的影响表明:从DNA条带的强弱上来看,Bath法最不适合深海沉积物DNA的提取,Zhou法和Microwave法提取DNA量最多;从DNA完整性上来看,Zhou法最适合于深海微生物DNA的提取。2)利用紫外分光光度计对提取的DNA进行回收效率的检测发现,柱子法和电泳法的回收效率均低于25%,但柱子法回收效率较电泳法高。3)DGGE条带可以反映所检测样品的微生物种群数量多少。以三种提取方法和两种回收方法得到的DNA为模板,两组DGGE引物进行种群多样性比较表明,用Zhou法提取、柱子法回收的DNA得到了最多的DGGE带谱;同时610bp的片段可以获得较210bp片段更多的谱带。 通过研究PCR反应条件对分子生物学方法检测微生物种群多态性的影响可见:1)高GC含量的模板不利于PCR扩增,但错配是造成PCR偏好性的决定性因素。2)退火温度升高会加剧因GC百分含量不同及错配造成的偏好:而低于47℃的退火温度可以有效的降低这两种因素引起的偏好。3)改变循环数不会有效的减小PCR偏好。同时,研究还表明,PCR产物中的条带代表的是群体中占有优势的物种。 利用提取纯化的样品总DNA为模板,扩增了细菌和古菌16S rDNA片段,并构建了相应文库。通过对文库克隆子的ARDRA分析,探讨了文库OTU多样性,结果表明:1)对细菌而言,EcoRI的酶切图谱条带数为1-3条,共分为11个带型;RsaI酶切图谱的条带数多为1-6条,其中以3-4条居多。文库多样性分析表明,文库覆盖率为59-76%,且以SH5的覆盖率最低。样品F120401与F120614有最低的相似性指数;与SH5有最高的相似性指数。2)对于古菌,构建了SH4和SH5的16S rDNA文库,大部分(80%)克隆子外源片段不能用EcoRI酶切,RsaI酶切带型复杂,表现出较细菌更为复杂的种群多样性。文库多样性分析表明,


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