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对虾白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用

王晓洁  
【摘要】:目前,白斑症病毒(white spot syndrome virus WSSV)严重影响虾的养殖,由于目前没有有效的药物治疗,因而,快速方便的检测方法势在必行,以期早发现,早预防。本论文进行的白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用,正是迎合此需要。 本论文是从本实验室原有的抗WSSV单克隆抗体库和本次实验制备的12株分泌抗WSSV单抗的细胞株中,采用间接荧光检测法,筛选出8株分泌较强的抗WSSV单抗的细胞株,将此细胞株通过制备腹水,扩增得到高效价的抗WSSV单抗,并将其纯化,用于白斑症病毒快速检测试剂盒的研制。 白斑症病毒快速检测试剂盒的研制,是用斑点免疫金渗滤法检测白斑症病毒。将WSSV包被在硝酸纤维膜上,通过标有红色胶体金的抗WSSV单抗经硝酸纤维膜渗滤,使抗原与抗体在膜上快速反应,从而标在抗WSSV单抗上的红色胶体金在膜上堆积、显色,来检测样品中的WSSV。本论文对以上8种从腹水中纯化得到的抗WSSV单抗,采用斑点免疫印迹法测其效价;采用Western-blot分析WSSV单克隆抗体的类型;采用免疫电镜对抗WSSV单抗作用的抗原决定簇分析。通过对这8种单抗效价、抗体类型、抗原决定簇的分析,选出效价较高、抗体类型属IgG、抗原决定簇在病毒囊膜上的单抗387,2E6、4G9为金标抗体。实验中发现WSSV囊膜极易破碎,为增强检测的灵敏度,因而将抗原决定簇在病毒核衣壳上的单抗2A3也选为金标抗体,通过不同检测模式的比较,得出最佳金标抗体为金标2E6和金标2A3等比混合液。并采用系列实验对试剂盒检测程序中的各项条件进行优化,使整个反应只需3分钟,并且不需要孵育及任何仪器设备。肉眼可见的红色斑点表示WSSV阳性。此法与斑点免疫印迹法比较,其灵敏度两者相同。但此法更为快速、方便、简单、现场、准确,并且无假阳性。 白斑症病毒现场检测试纸条的研制,是用一步免疫胶体金层析法检测白斑症病霉。用红色的胶体金标记抗WSSV的单抗2E6和2A3,通过不同模式的对比,选出抗WSSV的单抗4G9为最佳包被抗体,并将其包被在硝酸纤维膜上,采用双抗


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